南美白对虾副产物酶解工艺优化及其蛋白肽活性评价

吴泽龙,何建林,白锴凯,唐 超,张 怡,洪碧红*

(1.闽台特色海洋食品加工及营养健康教育部工程研究中心,福建 福州 350002;2.自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心,福建 厦门 361005;3.福建农林大学食品科学学院,福建 福州 350002)

南美白对虾(Penaeusvannamei)是中国主要的对虾养殖品种,占对虾养殖总产量的70%以上[1],在加工过程中产生的副产物(虾头虾壳)占整虾总重量40%～50%[2]。当前,虾加工副产物利用率低,绝大部分未经利用而被丢弃,造成严重的资源浪费和环境污染。但虾加工副产物中富含有价值的生物活性物质,包括蛋白质/肽[3]等,其中虾头中的蛋白质含量达6.38%[4],且氨基酸种类齐全。研究表明虾蛋白肽具有抗氧化[5-6]、降压[7]、降血糖[8-9]、增强免疫[10]、抗菌[11-12]等生物活性,还有安全性高、易于人体吸收等优点,可应用于开发膳食补充剂、功能性食品等[13-14]。目前,虾蛋白肽的提取方法主要包括酸碱法[15-16]、微生物发酵法[17]、酶解法等。在酸碱法中,常用碱法或碱溶酸沉法提取蛋白肽,其水解程度难以控制,蛋白提取率低,氨基酸易被破坏,环境污染严重。微生物发酵法则是将原料通过微生物发酵方式获得蛋白肽等物质,其机理尚未完全明确,发酵过程难以调控,产物复杂、杂质多。而酶解法具有水解高效、稳定性好、酶解过程易控制等优点[18],是当前制备食源性肽或活性肽的理想生产方法。近年来,利用酶解法制备虾蛋白肽成为高值化开发南美白对虾副产物的重要发展方向。因此,本研究以南美白对虾加工副产物为原料,考察不同外源酶对虾头内源酶自溶酶解的协同作用,筛选出对内源酶具有较好协同作用的碱性蛋白酶进行单因素试验,再经响应面法优化外源酶协同虾头内源酶自溶酶解工艺。最后,测定虾蛋白肽的分子量,并进行功效评价,以期为对虾加工副产物高值化利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与动物

南美白对虾加工副产物(新鲜虾头虾壳)由龙海市海澄万家福水产店提供。

胃蛋白酶(10万U/g),购自河南万邦实业有限公司;酸性蛋白酶(20万U/g)、中性蛋白酶(20万U/g)、碱性蛋白酶(20万U/g)、风味蛋白酶(2.5万U/g)、动物蛋白酶(10万U/g)、胰蛋白酶(2 500 USP U/mg)、菠萝蛋白酶(50万U/g),购自广西南宁庞博生物科技有限公司;高效凯氏定氮片,购自上海源叶生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl ,DPPH)、甘氨酸(75.07 Da)、维生素B12(1 355.37 Da)、抑肽酶(6 511.44 Da)、细胞色素C(12 400 Da),购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甘氨酰甘氨酸(189.17 Da),购自上海麦克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS),购自美国西格玛奥德里奇公司;地塞米松磷酸钠,购自罗恩试剂公司;印度墨汁,购自飞净科研试剂;胎牛血清(FBS)、PBS缓冲溶液、RPMI 1640 Medium(Giboc)、CCK8,购自北京索来宝科技有限公司;其余试剂均为市售分析纯。

BALB/c种小鼠(SPF级),体质量为16～18 g,雄性;动物许可证号：SCXK(沪)2017-0005,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。小鼠在温度(22±1)℃、相对湿度(55±5)%、12 h明暗交替的SPF级动物房中饲养。动物实验遵循自然资源部第三海洋研究所动物伦理委员会管理规定。

1.2 仪器与设备

SHA-B型水浴恒温振荡器,购自金坛市讯生仪器厂;CT14RD台式高速冷冻离心机,购自上海天美生化仪器设备工程有限公司;S210K 酸度计,购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;RCT digital S025 磁力器搅拌器,购自艾卡(广州)仪器设备有限公司;SCINO (KT260&DT208)定氮仪,购自福斯赛诺分析仪器苏州有限公司;SPPM-18S-1膜分离设备,购自三达膜科技(厦门)有限公司;1812卷式膜(编号116695,截留分子量：1 kDa),购自法国苏伊士公司;B-290喷雾干燥仪,购自瑞士布奇公司;AKTA purifierTM10蛋白层析仪,购自美国通用电气公司;UV-1780 紫外可见分光光度计,购自岛津仪器(苏州)有限公司;MC21S电子分析天平,购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SUNRISE酶标仪,购自奥地利蒂肯公司。

1.3 酶解工艺

南美白对虾副产物粉碎后制得虾头虾壳匀浆液,其中,新鲜虾头虾壳匀浆液为生基原料;生基原料经100 ℃ 灭酶10 min,即为熟基原料。根据试验条件进行酶解,反应结束后,于100 ℃ 灭酶10 min,待样品冷却后,于转速10 000 r/min离心10 min,取上清液并测定其氨基酸态氮含量并计算虾蛋白水解度。

1.4 外源酶的筛选

以粉碎后虾头虾壳生基或熟基匀浆液为原料,分别加入9种外源酶,酶添加量为原料的1%,在各自最适酶解条件下酶解3 h(表1),并以不加外源酶的生、熟基原料作为空白对照组(参考朱国萍等[19]的方法,结合前期实验,酶解温度为40 ℃,pH为8),探究外源酶协同虾头内源酶自溶酶解的作用。根据虾蛋白水解度对比不同外源酶及生、熟基原料对照组的酶解效果,筛选出最适外源酶。

表1 外源酶的酶解条件Tab.1 Enzymatic conditions for exogenous enzymes

1.5 外源酶协同虾头内源酶自溶酶解单因素试验

取粉碎后的虾头虾壳生基匀浆液为原料,以筛选的最适外源酶进行酶解,单因素试验分别考察不同因素对虾蛋白水解度的影响。各因素梯度为：酶添加量：1%、2%、3%、4%、5%;酶解时间：1、2、4、6、8 h;酶解温度：30、35、40、45、50、55 ℃;料液比：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。

1.6 外源酶协同虾头内源酶自溶酶解工艺响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上,选取试验中对虾蛋白水解度有显著影响的三因素,采用 Design-Expert 11.0 软件,按Box-Benken设计原理,以虾蛋白水解度作为响应函数,选取适当的响应面因素及其水平,通过响应曲面分析回归得出自变量与响应函数之间的统计模型,优化外源酶协同虾头内源酶自溶酶解工艺,试验因素水平编码如表2所示。

表2 响应面因素水平Tab.2 Variables and experimental design levels for response surface analysis

1.7 蛋白水解度的测定

通过测定酶解液中氨基酸态氮的含量和原料中总氮的含量,按公式(1)进行蛋白水解度(DH)计算。其中,氨基酸态氮的测定采取甲醛电位滴定法[20];总氮的测定参照《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[21],按凯氏定氮法测定。

(1)

式(1)中：X1为酶解液中氨基酸态氮含量;X2为原料中总氮含量。

1.8 挥发性盐基氮含量的测定

参照《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[22],按微量扩散法测定。

1.9 虾蛋白肽的分离及活性评价

1.9.1 虾蛋白肽的制备及分离

取粉碎后的虾头虾壳生基匀浆液为原料,加入碱性蛋白酶,按优化后酶解工艺条件进行酶解。反应结束后于100 ℃灭酶10 min,待样品冷却后,于转速10 000 r/min离心10 min,即得虾蛋白肽上清液。上清液用截留分子量为1 kDa的卷式膜分离,收集透过液,经浓缩、喷雾干燥即得虾蛋白肽粉末。

1.9.2 虾蛋白肽分子量的测定

参照《海洋鱼低聚肽粉》[23]标准测定收集的蛋白肽分子量,色谱条件：凝胶柱为SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL(10 mm×300 mm);流动相为乙腈-超纯水-三氟乙酸(45∶55∶0.1,体积比),流速0.5 mL/min;检测波长为220 nm。校正曲线所用的标准品：甘氨酸、二甘氨酰甘氨酸、维生素B12、抑肽酶、细胞色素C。

1.9.3 羟自由基清除能力测定

配制FeSO4溶液(8 mmol/L)、水杨酸溶液(3 mmol/L,避光保存)以及过氧化氢溶液(20 mmol/L)备用。取试管依次加入样品与上述溶液,涡旋混匀后置于37 ℃水浴锅中恒温30 min,反应结束后取出冷却至室温,再加入定量蒸馏水。于转速5 500 r/min条件下离心15 min,取上清液备用,记为A2样品组。用蒸馏水代替样品,经相同处理后,记为A1空白对照组。在510 nm处测定吸光值[24]。按公式(2)计算羟自由基清除率：

(2)

1.9.4 DPPH自由基清除能力测定

称取适量1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)粉末,溶解于无水乙醇,配制终浓度为0.5 mmol/L的DPPH溶液。取不同浓度样品溶液加入等体积DPPH溶液,为样品组B1;取不同浓度样品溶液加入等体积乙醇溶液,为对照组B2;取DPPH溶液加入等体积的乙醇溶液,为空白组B0。以上试验组涡旋混匀后,室温避光反应30 min,于517 nm处测定吸光度[25]。按公式(3)计算DPPH自由基清除率：

(3)

1.9.5 实验动物分组及给药

实验动物(BALB/c小鼠)适应性饲养10 d后,随机分为5组,包括阴性对照组、免疫低下模型组和虾蛋白肽给药组(低剂量1 mg/kg、中剂量10 mg/kg、高剂量100 mg/kg),每组11只。免疫低下模型组的造模方法采用隔日腹腔注射地塞米松,每次40 mg/kg,给药10次;阴性对照组注射等量的生理盐水。给药组和模型组一样给予地塞米松,给药方法为灌胃给予不同剂量的虾蛋白肽,连续灌胃给药21 d。阴性对照组、模型组灌胃同体积的无菌水。

1.9.6 虾蛋白肽对BALB/c鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

小鼠处死后,立即浸泡于75%酒精中5 min,无菌取出脾脏,在磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗2遍后,放置在盛有4 ℃预冷PBS的200目细胞筛中,注射器活塞研磨后,经细胞筛过滤即得脾细胞悬液。于1 500 r/min,4 ℃条件下,离心5 min,弃上清;加入Tris-HCl溶液混匀,同上述条件离心,弃上清,加入含10% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞,静置,以200 μL/孔铺96孔板(密度5×106个细胞/mL),2 h后加入虾活性肽及丝裂源LPS处理。46 h后,以1∶10的比例加入CCK8(20 μL/200 μL),培养3 h后在450 nm处检测光密度(OD)值[26]。

1.9.7 虾蛋白肽对免疫力低下模型小鼠免疫功能的影响

末次给药1 h后,从小鼠尾静脉注入印度墨汁(剂量为每10 g体重0.05 mL),立即计时,于2、8 min时分别从内眦静脉丛取血10 μL,并立即将其加到1 mL 0.1% Na2CO3溶液中。用全自动酶标仪在600 nm波长处测OD值,以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死,取肝脏和脾脏,用滤纸吸干脏器表面血污,称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力,按公式(4)、(5)计算廓清指数(K)值和吞噬指数(a),按公式(6)、(7)计算小鼠胸腺指数(b)和脾脏指数(c)[27]。

(4)

(5)

(6)

(7)

式(4)至(7)中：M1为小鼠处死后体质量(g);m1为肝脏质量(mg);m2为脾脏质量(mg);m3为胸腺质量(mg);M2为小鼠处死前体质量(g)。

1.10 数据处理方法

所有实验均进行 3 次平行实验,数据以均值±标准偏差表示,采用 Design-Expert 11.0、Excel 2016 和GraphPad Prism 8.0 软件分析处理数据。

2 结果与讨论

2.1 外源酶筛选结果

9种外源酶,在各自最适酶解条件下酶解3 h,与空白(无外源酶)相比,水解度均有提高,且外源酶的生基原料试验组水解度均高于熟基原料试验组,以碱性蛋白酶效果最优,其熟基试验组水解度为(26.50±0.23)%,生基试验组水解度高达(40.88±0.40)%(图1),表明碱性蛋白酶与南美白对虾内源酶自溶酶解具有较好的协同作用,因此,选用碱性蛋白酶与生基原料进行后续酶解工艺优化实验研究。

图1 外源酶对虾蛋白水解度(DH)的影响Fig.1 Effect of exogenous enzymes on the degree of shrimp proteolysis

2.2 外源酶协同虾头内源酶自溶酶解单因素试验

各因素对虾蛋白水解度的影响见图2。如图2(a)所示,随酶添加量增大,水解度呈上升趋势,当酶添加量为4%时,水解度达最大值。继续增加酶用量,水解度趋于平缓。这是由于酶添加量过高会影响酶活性中心对底物的定位和接近,抑制酶的活性[28],且继续增加酶用量,酶与底物结合趋于饱和,出现酶过剩现象,抑制酶解反应的进行[29],使得水解度趋于平缓。因此,选取酶添加量为4%。

图2 各因素对虾蛋白水解度(DH)的影响Fig.2 Effects of various factors on the degree of shrimp proteolysis

如图2(b)所示,酶解6 h时水解度达最高值,而后趋于平缓。酶解反应时间延长可能引起酶活力下降,底物肽链中可与酶活性位点结合的肽键数减少[30],导致水解度基本不变。因此,选取酶解时间为6 h。

如图2(c)所示,在酶解温度为40 ℃ 时水解度达到最高值,而后温度继续升高,酶的活性降低,甚至使其永久性失活,从而导致水解度降低[31]。因此,选取酶解温度为40 ℃。

如图2(d)所示,随着料液比升高,水解度显著增加。适宜的料液比,使得酶与底物在酶解时有充分的接触,从而提高水解度。过高的料液比,导致底物浓度降低,酶解速率减慢,酶解效率下降,水解度趋于平缓。因此,选取料液比为1∶5。

2.3 响应面优化外源酶协同内源酶自溶酶解工艺

2.3.1 响应面设计方案与实验结果

在外源酶协同虾头内源酶自溶酶解单因素试验的基础上,利用响应面优化进行酶解工艺条件的优化,响应面试验数据见表3。

表3 响应面实验设计与结果Tab.3 Response surface experimental factors and responses

2.3.2 二次回归拟合及方差分析

以虾蛋白水解度为响应值,根据表3的数据,利用 Design-Expert 11.0软件进行多元回归分析,拟合得到二次多项回归方程为：Y=49.71+0.586 3A-0.48B+2.15C-0.212 5AB+0.43AC-0.952 5BC-2.15A2-2.32B2-3.22C2。

该模型的方差分析见表4。模型(P<0.000 1)极显著,失拟项(P=0.221 1>0.05)不显著,相关系数R2=0.985 8,表明模型与试验结果拟合较好,预测值与实测值间具有高度的相关性。各因素对虾蛋白水解度的影响程度大小顺序为：酶解时间>酶添加量>酶解温度。

表4 回归系数模型及方差分析表Tab.4 Model summary and analysis of variance

2.3.3 各因素间对虾蛋白水解度交互作用的响应面分析

各因素间交互作用对虾蛋白水解度的影响,可从响应面与等高线的变化得到直观反映[32]。如图3所示,因素B与因素C曲线最为陡峭,等高线为椭圆形,说明酶解时间与酶解交互作用最为显著;因素A与因素B、因素A与因素C交互作用均不显著,其中因素A与因素B,曲线平滑,等高线为圆形,交互作用最弱,与方差分析结果一致。

图3 各因素交互作用对虾蛋白水解度影响的响应面图Fig.3 Response surface diagram of the interaction of various factors on the degree of shrimp proteolysis

2.3.4 响应面试验验证

采用 Design-Expert 11.0 软件优化功能,在试验因素取值范围内选择响应值最大值,可得到最佳试验条件：酶添加量4.05%、酶解温度39.90 ℃、酶解时间6.48 h,此时预测的酶解液中蛋白水解度为50.12%。根据试验实际操作可行性,取最优酶解条件为：酶添加量4%,酶解温度40 ℃,酶解时间6.5 h,试验重复3次,此条件下酶解,测得蛋白水解度实际值为(50.02±0.13)%,接近理论值。结果表明该工艺模型预测值与实际试验结果拟合度高,利用响应面法优化南美白对虾副产物酶解工艺准确可行。

2.4 挥发性盐基氮含量的测定结果

挥发性盐基氮含量与海水鱼、虾、头足类等水产品的新鲜度有明显的对应关系。《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》指出通过测定挥发性盐基氮含量可反应水产品的新鲜度,并要求海水鱼、虾、头足类挥发性盐基氮含量小于等于30 mg/100 g[21]。在响应面模型优化的最优酶解工艺条件下,检测在酶解过程中,虾加工副产物挥发性盐基氮含量的变化。如图4所示,在酶解0～6 h范围内,挥发性盐基氮含量平缓上升,在10 h才超过限定标准。结果表明：所用虾加工副产物原料新鲜度、加工适用性好,且在酶解时间8 h范围内,挥发性盐基氮含量不超限,可用于开展后续实验。

图4 挥发性盐基氮含量在酶解过程中的变化Fig.4 Changes of volatile base nitrogen content during enzymatic hydrolysis

2.5 虾蛋白肽分子量的测定及活性评价结果

2.5.1 虾蛋白肽分子量测定

选取5种标准品,通过标准品过凝胶柱的色谱图,测定虾蛋白肽样品的分子量。标准品对应的洗脱时间为：细胞色素C 9.25 min,抑肽酶11.73 min,维生素B12 15.10 min,二甘氨酰甘氨酸18.00 min,甘氨酸19.30 min。同等条件下测定虾蛋白肽的分子量。如图5所示,虾蛋白肽的分子量主要分布在1.5 kDa以下,其中75～1 355 Da占比为76.35%。

2.5.2 羟自由基清除率

活性肽的羟自由基清除能力主要由暴露的氨基酸侧链基团和肽序列所决定。与维生素C(VC)相比,虾蛋白肽清除羟自由基(·OH)的能力相对较弱(图6)。随着反应浓度的增加,两者清除·OH的能力也随之升高。通过GraphPad Prism 8.0分析拟合并计算半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50),可得VC的IC50为0.17 mg/mL,虾蛋白肽的IC50为4.64 mg/mL,表明虾蛋白肽具有一定的清除·OH能力。

图6 VC和虾蛋白肽对·OH的清除作用Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of VC and shrimp peptide on ·OH

2.5.3 DPPH自由基清除率

如图7所示,VC和虾蛋白肽对DPPH的清除率随着样品浓度的增加而呈上升趋势,存在量效关系。当虾蛋白肽含量在5 mg/mL 时,DPPH清除率达到了85.13%。通过GraphPad Prism 8.0分析拟合并计算,可得VC的IC50为0.03 mg/mL,虾蛋白肽的IC50为3.08 mg/mL。表明虾蛋白肽具有一定的DPPH清除能力。

2.5.4 虾蛋白肽对BALB/c鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

机体的特异性免疫主要包括细胞免疫和体液免疫。在细胞免疫中,淋巴细胞增殖活性的提高对机体免疫具有正向调节作用。如图8所示,虾蛋白肽单独给药对淋巴细胞的增殖无影响;但是同时添加虾蛋白肽(1 μg/mL或10 μg/mL)和丝裂源LPS(10 μg/mL)具有促进作用,显著刺激了小鼠淋巴细胞增殖,且与丝裂源LPS(10 μg/mL)相比有统计学意义,表明虾蛋白肽具有一定的促进淋巴细胞增殖的作用。

图8 虾蛋白肽对脾淋巴细胞增殖的影响Fig.8 Effect of shrimp peptides on the proliferation of splenic lymphocytes“***”表示P<0.001(与对照组相比);“#”表示P<0.05,“##”表示P<0.01(与LPS组相比)。

2.5.5 虾蛋白肽对免疫力低下模型小鼠免疫功能的影响

吞噬指数反映了巨噬细胞的吞噬能力,进而反映机体非特异性免疫水平。而胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官,免疫器官的质量变化可反映机体的免疫功能,免疫器官质量增加为免疫增强的表现,反之则为免疫抑制。如图9所示,模型组小鼠的吞噬指数、胸腺指数、脾脏指数明显降低,说明免疫力低下的模型成功建立。用虾蛋白肽给药21 d的小鼠,3个剂量组均能显著提高免疫低下模型小鼠的胸腺指数,中剂量组(10 mg/kg)能显著提高吞噬指数和脾脏指数。以上结果表明虾蛋白肽能使免疫力低下小鼠的免疫器官增重并提高免疫细胞的吞噬能力,显示出提高免疫力的功效。

图9 虾蛋白肽对免疫抑制小鼠吞噬指数、胸腺指数和脾脏指数的影响Fig.9 Effects of shrimp peptides on phagocytic index,thymic index,and splenic index in immunosuppressed mice“*”表示P<0.05,“***”表示P<0.001(与阴性组相比);“#”表示P<0.05,“##”表示P<0.01,“###”表示P<0.001(与模型组相比)。

2.6 讨论

利用酶解法提取蛋白肽,主要包括内源酶自溶酶解法及外加酶复合酶解法。内源酶自溶酶解法对副产物虾头虾壳的水解能力普遍不足,本研究采用9种外源蛋白酶与虾头内源酶对虾头虾壳进行复合酶解,结果表明：碱性蛋白酶对虾头内源酶具有较好的协同作用,经单因素试验及响应面优化后的虾蛋白水解度达(50.02±0.13)%,高于蓝尉冰等的碱性蛋白酶解工艺[虾蛋白水解度为(43.88±0.03)%][33]和何颖恒等的超声波辅助碱性蛋白酶与中性蛋白酶复合酶解(虾蛋白平均水解度为42.5%)[34],本研究的酶解工艺更具优势。

文献报道酶解工艺制备的虾蛋白肽具有显著的抗氧化、清除自由基、免疫调节、保护肝肾等功能,而且虾蛋白肽的活性与酶解位点及蛋白肽的分子量紧密相关。如分子量小于 6 kDa的低分子量肽更容易穿过胃肠屏障与目标物质结合发挥作用[35]。王晋等采用风味蛋白酶制备虾蛋白肽,其中3～10 kDa的多肽组分具有显著的抗氧化作用[36]。黄湛媛等采用中性蛋白酶酶解,从竹节虾(Penaeusjaponicus)虾头酶解产物中分离制备抗氧化肽中分子量在<3 kDa的组分具有显著的抗氧化活性[37]。姜烁琦经体外模拟胃肠道消化制备低分子量(小于1 kDa的组分占84.38%)中华管鞭虾(Solenoceracrassicornis)虾头肽,其低分子量肽可增强小鼠体液免疫、细胞免疫及改变肠道菌群结构,改善小鼠免疫低下,并恢复小鼠的肝肾代谢功能[38]。可见,低分子肽段可能显示出更佳的生物学功效。本研究采用碱性蛋白酶协同虾头内源酶自溶酶解,酶解产物经膜分离后获得的虾蛋白肽分子量主要分布在1.5 kDa以下,属于低分子量肽段。此虾蛋白肽对羟自由基、DPPH自由基具有一定的清除能力,较方磊等报道的南极磷虾肽的羟自由基清除能力[39]更优。此外,虾蛋白肽可显著促进淋巴细胞增殖,并能显著提高小鼠的胸腺指数,特别是中剂量组(10 mg/kg)能显著提高吞噬指数和脾脏指数,显示出免疫增强功效。后续工作可结合虾蛋白肽的氨基酸序列研究,探究虾蛋白肽的结构特征与其功效活性(抗氧化、免疫调节等)的构效关系,为开发高质化功能性蛋白肽产品奠定基础。

3 结论

本研究以南美白对虾加工副产物(虾头虾壳)为原料,通过外源酶协同虾头内源酶自溶酶解工艺制备虾蛋白肽,并对其进行功效评价。结果表明碱性蛋白酶协同内源自溶酶具有较好的酶解效果。通过单因素试验及响应面实验优化,得到最佳酶解工艺条件为：酶添加量4%、酶解时间6.5 h、酶解温度40 ℃、料液比1∶5。在此条件下,虾蛋白水解度为(50.02±0.13)%,且在酶解8 h内,虾加工副产物的挥发性盐基氮含量符合《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》限定标准。酶解产物经膜分离后,所得虾蛋白肽分子质量主要分布在75～1 355 Da,占比为76.35%,其对羟自由基、DPPH的IC50分别为4.64 mg/mL和3.08 mg/mL ,具有一定的自由基清除能力。此外,南美白对虾副产物虾蛋白肽能促进淋巴细胞增殖,改善胸腺和脾脏萎缩,提高免疫细胞的吞噬能力,显示出较明显的免疫增强功效,具有开发成为功能性免疫调节剂的潜能,值得深入研究和开发。