深海噬菌体BVE2内溶素的重组表达及其活性研究

张天佑,陈 源,余美舜,张蒙辉,3,金 敏,曾润颖*

(1.自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物遗传资源重点实验室,福建 厦门 361005;2.自然资源部第三海洋研究所、自然资源部海洋生物资源开发利用工程技术创新中心,福建 厦门361005;3.先进制造学院,福州大学,福建 福州362200)

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)和坎氏弧菌(V.campbellii)等弧菌广泛地存在于河口和海洋等生态环境中,是我国乃至世界范围内导致养殖水产品死亡和引起人类肠道疾病的主要病原菌[1-3]。因其较强的适应能力和抗逆性,弧菌成为海洋环境中的优势种群,经常作为致病菌导致疾病的暴发与流行。据不完全统计,我国每年因弧菌而导致的贝类病害造成的直接经济损失就可高达20～30亿元,其中以副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌、创伤弧菌(V.vulnificus)和哈维氏弧菌(V.harveyi)等弧菌为代表的高致病性耐药性弧菌为主[4];在对虾养殖中,V.harveyi、V.alginolyticus、V.parahaemolyticus等弧菌往往可以引起对虾早期死亡综合症、白便、肠炎、红体、烂鳃、黄腿,严重影响对虾的健康养殖[5];同时,近年来,由于V.parahaemolyticus、V.alginolyticus感染导致的肠胃炎病例呈上升趋势。以我国江阴市为例,2006—2010年间由弧菌引起的食源性疾病占细菌性食物中毒事件的首位,约为38.71%,对人类的身体健康产生了一定的影响[6]。与此同时,自抗生素发明以来,其高效和快速灭菌的特性使其迅速成为人们依赖的杀灭细菌方法,但随着抗生素的广泛使用,多种新型耐药细菌迅速出现,传统的抗生素已经不能有效的杀灭细菌[7]。然而新型抗生素的研究发展速度缓慢,因此开发新型的抗菌剂迫在眉睫[8-9]。

内溶素(Lysin)是一类由噬菌体编码的酶,可以在噬菌体裂解周期的最后阶段降解细菌细胞壁中的肽聚糖结构,使细菌破裂死亡并释放子代噬菌体[10]。由于内溶素具有高的宿主特异性且不会引起细菌的耐药性,使其已成为控制细菌的新策略,并且得到了越来越多的关注[11-14]。内溶素对革兰氏阳性菌的抑制作用较好,因为外部添加的内溶素可以直接作用于细胞壁上的肽聚糖并使之降解[15],而革兰氏阴性菌通常对外源性内溶素作用不敏感,因为其外膜可以作为物理屏障阻挡内溶素[16-17]。

本研究中,我们对西南印度洋沉积物样品中的噬菌体BVE2进行了全基因组测序[18],从中筛选得到噬菌体BVE2的内溶素基因Lysin132,并进行了进一步的的生物信息学分析,成功克隆表达了BVE2内溶素基因Lysin132,并纯化得到了重组BVE2 Lysin132,抑菌实验结果表明其对V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi等弧菌具有较好的抑制效果。这些结果将为重组BVE2 Lysin132用作食品保鲜、水产养殖、医药等领域的新型抑菌剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和表达系统

噬菌体BVE2分离自西南印度洋深海沉积物,宿主为Bacillussp.E171,通过基因组分析表明,噬菌体BVE2属于Caudovirales目、Siphoviridae科的新成员[18]。用于抑菌实验的菌株(V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.plantisponsor、V.diazotrophicus)均为实验室在前期工作中分离保藏。原核表达载体pEASY-Blunt E2 Expression Vector和表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)菌株购自TransGen Biotech公司。

1.1.2 酶、试剂和试剂盒

2×Phanta Max Buffer、dNTP Mix (10 mmol/L)、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、PCR产物纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、Ni2+柱His-蛋白纯化试剂盒为Thermo公司产品。异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺为索莱宝公司产品,其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 培养基及培养条件

表达宿主E.coliBL21(DE3)使用LB培养基(每1 L液体培养基包含10 g胰蛋白胨、10 g氯化钠、5 g酵母粉;固体培养基另加15 g/L的琼脂),在37 ℃以200 r/min振荡培养。Bacillussp.E171同样使用LB培养基,在30 ℃以200 r/min振荡培养。V.alginolyticus、V.campbellii、V.ziniensis使用2216E培养基(每1 L液体培养基包含2 g酵母粉、10 g蛋白胨;固体培养基另加15 g/L的琼脂),在30 ℃以200 r/min振荡培养。其他抑菌实验相关菌株使用TCBS培养基(每1 L液体培养基包含5 g酵母粉、10 g蛋白胨、10 g氯化钠、10 g柠檬酸钠、10 g硫代硫酸钠、3 g胆酸钠、5 g牛胆汁粉、20 g蔗糖、1 g柠檬酸铁、0.04 g溴麝香草酚蓝、0.04 g麝香草酚蓝;固体培养基另加15 g/L的琼脂),在30 ℃恒温培养箱中培养。

1.2 实验方法

1.2.1 BVE2内溶素基因的PCR扩增

根据BVE2基因组中的内溶素序列设计了一对PCR扩增引物：正向引物为5′-GAAATTCAAAAAA AATTAGTTAATCCAAGTAAGTATGGTAC-3′;反向引物为5′-TTTAACTTCATACCACCAACCTTTACGG-3′。以Bacillussp.E171和BVE2共培养的菌液为模板进行内溶素基因的扩增,50 μL PCR反应体系为：2×Phanta Max Buffer 25 μL、dNTP Mix(10 mmol/L) 1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、正向引物(10 μmol/L) 1 μL、反向引物(10 μmol/L) 1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 20 μL。PCR反应程序：为95 ℃预变性180 s,95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,变性、退火、延伸重复30个循环,72 ℃彻底延伸300 s。待PCR反应完成后,用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物。

1.2.2 BVE2内溶素表达菌株的构建

扩增产物由PCR产物纯化试剂盒进行纯化后回收,与pEASY-Blunt E2 Expression Vector轻轻混合,室温25 ℃反应5 min,反应结束后将产物置于冰上;通过化学转化法将连接产物导入表达宿主E.coliBL21(DE3)中,随后将重组菌株涂布于LB琼脂固体平板上(含100 μg/mL的氨苄青霉素),37 ℃培养12 h。提取重组质粒,用目的基因的正向引物和T7 Terminator Primer鉴定阳性克隆的连接方向,选择连接正确的阳性克隆进行测序验证。

1.2.3 重组BVE2 Lysin132的诱导表达

挑选测序正确的表达宿主E.coliBL21(DE3)单菌落至5 mL液体LB(含100 μg/mL的氨苄青霉素)培养基试管中,37 ℃,200 r/min培养2 h。再按1%的比例转接至50 mL液体LB(含100 μg/mL的氨苄青霉素)培养基中,37 ℃振荡培养2～3 h至菌液OD600=0.8,向50 mL培养基中加入0.1 mol/L IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,在16 ℃,200 r/min下继续振荡培养12 h后,以8 000 r/min离心20 min收集菌体,向菌体细胞中加入10 mL 磷酸盐缓冲液(pH=7.4),重悬后使用超声破碎细胞仪(舜玛SM-1500D,300 W)破碎细胞。破碎完成后,以10 000 r/min、4 ℃离心20 min,收集上清液用于重组BVE2 Lysin132蛋白的纯化。

1.2.4 重组BVE2 Lysin132的纯化

将上述收集获得的上清液与Ni2+亲和层析柱孵育结合30 min,采用清洗缓冲液(25 mmol/L咪唑溶于磷酸盐缓冲液中,pH=7.4)在4 ℃下清洗多次后,用洗脱缓冲液(250 mmol/L咪唑溶于磷酸盐缓冲液中,pH=7.4)洗脱获得重组BVE2 Lysin132。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测洗脱的重组蛋白。

1.2.5 重组BVE2 Lysin132的酶活性测定

按照《溶菌酶活性检测方法》[19]测定重组BVE2 Lysin132的活性。采用LB液体培养基培养溶壁微球菌标准菌株(Micrococcuslysodeikticus,CGMCC 1.634,购自北京北纳创联生物技术研究院),将培养至对数期的菌液离心(10 000 r/min,20 min)收集菌体,用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤菌体至无培养基状态,后用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液将菌液OD450调节至1.300,在反应管中加入2.5 mL菌悬液,加入0.5 mL内溶素,记录反应1 min时OD450的读数A1,反应2 min时的读数A2,溶菌酶活力计算公式为：

(1)

式(1)中：I为内溶素的酶活力,E为检测用内溶素的质量。内溶素的酶活力定义为：在25 ℃,0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中,以溶壁微球菌为底物,每分钟使OD450下降0.001时所需的酶量。

1.2.6 重组BVE2 Lysin132酶学性质分析

酶学性质分析主要包括最适温度、最适pH值、pH稳定性、热稳定性、金属离子以及抑制剂与螯合剂对酶活性的影响、抑菌实验等几个方面。

①最适温度。以OD450=1.300的溶壁微球菌为底物,设置不同温度梯度：10、20、30、40、50、60、70 ℃,在最适pH下测定不同反应温度下的酶活力,将酶活力最高值定义为100%,计算其余的相对酶活力,确定最适酶反应温度,每组样品均设置3个平行对照。

②最适pH值。配制一系列不同pH值的缓冲液：柠檬酸-柠檬酸钠(pH值分别为3.01、4.04、5.02、6.05、7.09),Tris-HCl(pH值分别为7.04、8.06、9.08),NaOH-Gly(pH值分别为9.02、10.08、11.03),分别用以上缓冲液配制OD450=1.300的溶壁微球菌菌液,在最适温度下测定不同pH条件下的酶活力,将酶活力最高值定义为100%,计算其余的相对酶活力,确定酶最适pH值,每组样品均设置3个平行对照。

③热稳定性。以OD450=1.300的溶壁微球菌为底物,将酶分别置于不同温度的水浴锅(10～60 ℃)中孵育10、20、30、60、90 min,在最适pH值下测定残余酶活力,将酶活力最高值定义为100%,计算其余的相对酶活力,每组样品均设置3个平行对照。

④pH稳定性。以OD450=1.300的溶壁微球菌为底物,将酶分别置于不同pH值的缓冲液(pH 3.0～11.0)中耐受10、20、30、60、90 min,在最适温度下测定残余酶活力,将酶活力最高值定义为100%,计算其余的相对酶活力,每组样品均设置3个平行对照。

⑤金属离子对酶活性的影响。将不同金属离子预先与酶在最适温度和pH值条件下孵育10 min,以OD450=1.300的溶壁微球菌为底物,使金属离子的反应终浓度分别为0.1、1.0、10.0 mmol/L。并以不加金属离子的反应体系为对照,测定残余酶活力。将不添加金属离子时的酶活力定义为100%,计算其余的相对酶活力,每组样品均设置3个平行对照。

⑥抑制剂和螯合剂对酶活性的影响。将EDTA、SDS、PMSF、Tween-20、DTT和Triton X-100预先与酶孵育10 min,以OD450=1.300的溶壁微球菌为底物,以不加酶抑制剂或螯合剂的反应体系为对照,在最适反应条件下测定残余酶活力。将不加酶抑制剂或螯合剂时的酶活力定义为100%,计算其余的相对酶活力,每组样品均设置3个平行对照。

⑦抑菌实验(打孔法)。以市售的蛋清溶菌酶(沧州夏盛酶生物技术有限公司,2 000 U/mg)和微生物溶菌酶(沧州夏盛酶生物技术有限公司,3 000 U/mg)为对照,在相同酶浓度(2 mg/mL)下进行抑菌效果的比较。以V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.diazotrophicus等实验室现有的弧菌为受试菌株,经活化后加入已冷却至50 ℃左右的平板培养基中,混合均匀,倾注平板,待平板充分凝固后,以灭菌的打孔器在平板上均匀打孔,小心挑去培养基小块做成圆孔,向孔中加入100 μL浓度为2 mg/mL的重组BVE2 Lysin132、蛋清溶菌酶和微生物溶菌酶,4 ℃预扩散2 h,37 ℃下恒温培养12 h,以游标卡尺采用十字测量法测定抑菌圈直径,以抑菌圈直径表示抑菌圈的大小,每组实验设置3个平行对照,最终统计结果均为重复3次取平均值所得。其中,增长率是指重组BVE2 Lysin132的抑菌圈直径与微生物溶菌酶的抑菌圈直径相比的增加量。

2 结果与讨论

2.1 BVE2 内溶素基因的序列分析

根据基因预测的结果,从噬菌体BVE2的基因组中发现了一段全长702 bp,编码噬菌体内溶素的开放阅读框(ORF),命名该ORF为Lysin132。Lysin132所编码的蛋白(BVE2 Lysin132)由234个氨基酸残基组成,预计分子量为25.74 kDa;经BlastP比对后,发现GenBank中已有蛋白的氨基酸序列与BVE2内溶素氨基酸序列相似度较高,选取BlastP结果中与BVE2内溶素同源性最高的6条序列,与BVE2内溶素氨基酸序列进行多重氨基酸序列比对(图1),结果发现BVE2 Lysin的氨基酸序列中存在着由His29、His129、Cys137、Tyr46、Lys135组成的酰胺酶催化活性位点,这些催化活性位点在不同的酰胺酶中具有高度的保守性,同时也是维持酰胺酶活性的必须序列,因此推测BVE2 Lysin是一种N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。

图1 BVE2 Lysin132的保守序列分析Fig.1 Conserved sequence analysis of BVE2 Lysin132用于比对的6条氨基酸序列的GenBank登录号为GCA_002605725.1、GCF_000916355.1、GCF_000008445.1、GCA_002951935.1、GCA_002617305.1、GCA_003368845.1;阴影部分代表N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶保守基序的氨基酸残基。

根据BlastP的比对结果,选取与BVE2 Lysin132内溶素同源性较高的氨基酸序列,采用邻接法构建系统发育树(图2),在进化树上BVE2 Lysin132与Bacillusvirus Wbeta(gb | ABC40416.1)中的N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶聚为一类,表明BVE2 Lysin132是一种酰胺酶。

图2 BVE2 Lysin132氨基酸序列的进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of BVE2 Lysin132 based on amino acid sequence

2.2 重组BVE2 Lysin132的表达及纯化

将Lysin132克隆到pEASY-Blunt E2 Expression Vector中,并构建E.coli-pEASY-Lysin132表达菌株。SDS-PAGE的结果显示,经过IPTG诱导表达后,发酵液上清中出现一条分子量约为25 kDa的蛋白条带(图3,箭头所示)与预测的重组BVE2 Lysin132分子量一致,表明基因Lysin132在大肠杆菌中成功得到了异源表达。含有重组蛋白的上清液经过Ni2+亲和层析柱纯化后得到了单一条带的重组蛋白。

图3 重组BVE2 Lysin132的诱导表达与纯化Fig.3 Inducible expression and purification of recombinant BVE2 Lysin132泳道M为蛋白marker,泳道1为E. coli-pEASY-Lysin132未诱导总蛋白,泳道2为诱导后总蛋白,泳道3～7为顺序洗脱的重组BVE2 Lysin132;箭头指示位置为目标蛋白。

2.3 重组BVE2 Lysin132基本酶学性质分析

2.3.1 最适反应温度

重组BVE2 Lysin132的最适反应温度为30 ℃,在20～45 ℃范围内具有50%以上的酶活力,在10 ℃左右仍然具有20%以上的酶活力,20 ℃左右则具有50%左右的酶活力(图4),表现出一些低温内溶素的特性,这可能与其来源于深海低温环境有关。

图4 重组BVE2 Lysin132的最适反应温度Fig.4 Optimal reaction temperature of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.2 最适反应pH值

重组BVE2 Lysin132的最适反应pH为7.0,30 min内,当pH值在5.0～9.0时具有40%以上的酶活力(图5),当pH值在6.0～8.0时则具有80%以上的酶活力,表明其有较宽的pH作用范围。

图5 重组BVE2 Lysin132的最适pH值Fig.5 Optimal pH value of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.3 热稳定性

重组BVE2 Lysin132在10～40 ℃下孵育90 min以上仍能保持80%以上的酶活力,在50 ℃的水浴中孵育90 min则剩余70%左右的酶活力,在60 ℃水浴中孵育90 min仍剩余约40%的酶活力(图6),说明其具有良好的耐高温能力。

图6 重组BVE2 Lysin132的热稳定性Fig.6 Thermal stability of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.4 pH稳定性

重组BVE2 Lysin132在pH值为6.0～8.0的缓冲液中相对较为稳定,孵育90 min仍保持75%左右的相对酶活力。但在强酸、强碱条件下均不稳定,总体而言,其对碱性条件的耐受性优于对酸性条件(图7)。

图7 重组BVE2 Lysin132的pH稳定性Fig.7 pH stability of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.5 金属离子对酶活性的影响

从表1可以看出,重组BVE2 Lysin132的酶活力随着Na+浓度的增高逐渐升高;Mg2+在0.1 mmol/L时对酶活力的促进作用要比10 mmol/L和1 mmol/L强一些,可见低浓度的Mg2+对酶活力有显著的促进作用;K+对酶活力的促进作用与Zn2+类似,并不明显;Ca2+对酶活力的促进作用在1 mmol/L时达到最高(143%左右),后续可进一步探究Ca2+对酶活力促进作用的机制;低浓度Mn2+、Ba2+对酶活力均有一定的促进作用;反之,Fe3+、Cd2+对酶活力的抑制作用都很明显,且随着浓度的增加抑制作用逐渐增强,在10 mmol/L时均可使酶完全失活。

表1 金属离子对重组BVE2 Lysin132酶活力的影响Tab.1 Effects of metal ions on the activity of recombinant BVE2 Lysin132

2.3.6 抑制剂和螯合剂对酶活性的影响

从图8可以看出Tween-20、Tritonx-100、PMSF对重组BVE2 Lysin132具有强抑制作用,SDS、DTT有一定的抑制作用,EDTA有轻微的抑制作用。

图8 抑制剂和螯合剂对重组BVE2 Lysin132酶活力的影响Fig.8 Effects of inhibitors and chelating agents on the activity of recombinant BVE2 Lysin1321为空白对照,2为0.1% Tween-20,3为0.1% Triton X-100,4为EDTA(1 mmol/L),5为SDS(1 mmol/L),6为PMSF(1 mmol/L),7为DTT(1 mmol/L)。

2.3.7 抑菌活性

以V.alginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.plantisponsor、V.diazotrophicus等弧菌为指示菌,并与市售的蛋清溶菌酶和微生物溶菌酶在相同酶浓度(2 mg/mL)下进行抑菌效果的比较,结果如下(表2)。由于蛋清溶菌酶对弧菌的抑制作用并不明显,我们重点比较了微生物溶菌酶与重组BVE2 Lysin132对不同弧菌抑菌效果的差异,结果表明,重组BVE2 Lysin132对除了V.diazotrophicus之外的受测弧菌的抑菌效果均明显优于市售微生物溶菌酶。

表2 重组BVE2 Lysin132与蛋清溶菌酶、微生物溶菌酶对不同弧菌的抑菌活性Tab.2 Antibacterial activity of recombinant BVE2 Lysin132,egg white lysozyme and microbial lysozyme against different Vibrio

2.4 讨论

虽然越来越多的深海微生物资源得到了勘探与挖掘,但目前关于深海噬菌体来源的资源研究仍然不多。重组BVE2 Lysin132的成功表达,表明深海噬菌体有可能会成为酶资源挖掘的一个重要来源。已报道的深海来源的噬菌体内溶素GVE2,其最适温度为60 ℃,仅在40～80 ℃的温度范围内具有酶活性[20]。而我们的研究结果表明：重组BVE2 Lysin132的热稳定性良好,在10～40 ℃的条件下孵育90 min后仍能保持80%以上的酶活力,具有低温酶的一些特性,可能在食品保鲜、防腐等方面有一定的应用潜力。

由于绝大多数的革兰氏阴性菌均具有一层外膜结构来保护其自身免受内溶素的影响,因此很多内溶素在发挥作用前需要先使用外膜透化剂来破坏细菌外膜的稳定性,进而才能达到溶解细菌的目的[11]。例如针对副溶血弧菌的内溶素Lysqdvp001在未经EDTA预处理时并不能有效抑制副溶血弧菌[21],而针对溶藻弧菌的内溶素cwlQ则需要与其HolA蛋白协同作用才能有效杀灭弧菌,单独的内溶素cwlQ对溶藻弧菌并无抑制效果[22]。其他几种增加革兰氏阴性菌外膜渗透性的方法包括使用螯合剂EDTA、阳离子试剂或有机酸[23]、内溶素的N端连接疏水性肽等方法[24]。在本研究中,我们发现在不使用外膜透化剂或其他蛋白协同的情况下,重组BVE2 Lysin132仍然可以对部分革兰氏阴性菌有一定的抑制效果,尤其是对Vibrioalginolyticus、V.campbellii、V.harveyi、V.ziniensis、V.diazotrophicus等弧菌有较强的抑制作用。在同一酶浓度的条件下,与市售的微生物溶菌酶相比,抑菌效果最大提升了40%以上。鉴于弧菌在水产养殖,尤其是对虾、贝类养殖中的危害,重组BVE2 Lysin132在水产养殖方面具有潜在的应用价值,且在实际应用中可以免去使用外膜透化剂,这可以缩小养殖成本,更好地保护水产养殖周围的生态环境。

3 结论

BVE2是一株来源于西南印度洋沉积物中的新型噬菌体,对其基因组中关键蛋白的表达和功能分析表明BVE2的内溶素基因Lysin132是一种编码N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的基因。酶学性质分析表明重组BVE2 Lysin132的最适反应温度为30 ℃,且在10～50 ℃下孵育90 min,仍能保持70%左右的酶活力,具有良好的热稳定性;最适pH为7.0,且具有较宽的pH作用范围;Na+、Ca2+、Mg2+对其有明显的激活作用,均可使酶活力显著提高20%以上,Fe3+、Cd2+在10 mmol/L的浓度下均可使其完全失活,抑制作用明显。抑菌实验的结果证实,重组BVE2 Lysin132对Vibrioalginolyticus、V.campbellii、V.harveyi等弧菌的抑制效果显著。这些结果表明,重组BVE2 Lysin132在食品保鲜,以及水产养殖中具有潜在的应用价值。