姜黄素保护急性肝损伤的作用及机制研究

谢一潋 邬怡怡 吴洲笑

肝脏在受到药物、缺血、外源性毒物等因素所致的损害时，会出现急性肝损伤，严重时可致急性肝衰竭并危及生命[1]。姜黄素是从姜黄的根茎中提取的一种酚类化合物，对于药物或有毒物质所致肝损伤及其他类型的肝病均有不同程度的预防或治疗作用[2]。既往研究发现，姜黄素可改善脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）所致的急性肝损伤，而自噬在其中可发挥保护作用[3]。线粒体自噬作为一种重要的选择性自噬，是否参与其中，以及如何发挥保护作用，还需进一步研究。核酸结合寡聚结构域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）样受体家族3（NOD-like receptors，NLRP3）炎症小体是一种细胞内多蛋白复合体，参与了各种肝脏疾病的炎症和免疫反应。多项研究显示，NLRP3 炎症小体在LPS/D-GalN 导致的肝损伤中有重要作用，抑制NLRP3 通路减少炎症因子的释放，可达到改善肝损伤的目的[4-6]。有研究认为，线粒体自噬能抑制NLRP3 炎症小体，从而治疗炎症性疾病[7-9]。在LPS/D-GaIN 诱导的急性肝损伤动物模型中，姜黄素可能通过线粒体自噬-NLRP3 炎症小体通路起保护作用，但相关报道鲜见。基于此，本研究拟探讨姜黄素在急性肝损伤中的作用，分析其作用机制，以期为其用于急性肝损伤的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 30 只雄性SPF 级SD 大鼠，180～220 g，购自上海斯莱克有限公司，适应性饲养1 周，饲养环境：20～25 ℃，相对湿度40%～70%。

1.2 主要试剂 姜黄素（批号：shbn9867）购自美国Sigma 公司，用0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液配制成24 g/L 药液，备用；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（批号：0000136326）购自美国Sigma 公司，用二甲基亚砜配制成5 mmol/L，备用；LPS（批号：0000129517）、D-GalN（批号：slcf9830）和ATP 检测试剂盒（批号：MAK190）均购自美国Sigma 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：092822221202）、β-肌动蛋白（β-actin）（批号：AF0006）和JC-1 检测试剂盒（批号：C2006）购自碧云天生物技术有限公司；山羊抗兔IgG 抗体（批号：GAR0072）和红细胞裂解液（批号：MR0504-500）购自杭州联科生物技术股份有限公司,山羊抗小鼠IgG 抗体（批号：GAM007）购自杭州联科生物技术股份有限公司；大鼠IL-1β ELISA 检测试剂盒（批号：mL003057）购自酶联生物科技有限公司。抗体NLRP3（批号：ab263899）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）（批号：ab286125）、IL-1β（批号：ab283818）和PTEN 诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）（批号：ab186303）购自美国Abcam 公司；Parkin（批号：4211T）购自美国CST 公司。

1.3 动物分组及建模 30 只大鼠按随机数字表法分为对照组、肝损伤组、姜黄素组、3MA 组和姜黄素+3MA 组，每组6 只。除对照组外，其余4 组将LPS 和DGalN 按照10 μg/kg 和800 mg/kg 的质量分数用800 μL的无菌0.9%氯化钠注射液溶解后，一次性腹腔注射，建立急性肝损伤模型。预实验观察到肝脏组织结构排列紊乱，中央静脉及肝窦扩增，可见点灶性坏死和严重充血，并伴随炎症细胞侵润，提示造模成功。对照组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠注射液。造模前5天，姜黄素组和姜黄素+3MA 组大鼠按5.00 mL/kg 剂量灌饲姜黄素药液，对照组、肝损伤组和3MA 组按5.00 mL/kg剂量灌饲CMC-Na溶液，1次/d[3]。造模前2 h，3MA 组和姜黄素+3MA 组大鼠腹腔注射3.35 mL/kg 的3MA 药液[3]，其余各组腹腔注射3.35 mL/kg 的二甲基亚砜。造模后12 h，颈椎脱臼法处死大鼠并收取血液和肝脏组织。血液经室温静置30 min，3 000 r/min 离心20 min，收集上层淡黄色血清，存放于-20 ℃冰箱。新鲜肝脏组织部分浸泡于4%甲醛中固定，部分经液氮瞬时冷冻后转移至-80 ℃冰箱保存，剩余组织按要求保存备用。

1.4 指标测定

1.4.1 各组大鼠肝组织病理检查 采用HE 染色。肝脏组织经甲醛固定3～5 d，修块、脱水、透明、浸蜡、包埋后进行切片，染色后显微镜下观察。

1.4.2 各组大鼠肝组织细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测 采用JC-1 流式检测。新鲜肝脏组织经预冷的PBS 漂洗2 遍，浸泡于预冷的1640 培养基中。取出组织剪碎研磨，收集悬液后PBS 漂洗2 遍，加入复合酶消化液，1 000 r/min 离心5 min，收集沉淀，红细胞裂解液裂解后1 000 r/min 离心5 min ，离心2 次弃去上清液，用1 mL 的1640 培养基重悬。PBS 洗涤细胞，1 000 r/min 4 ℃离心5 min，加入1 mL 的JC-1 染色工作液，充分混匀后，放入37 ℃的细胞培养箱中孵育20 min。4 ℃下1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用预冷的JC-1 染色缓冲液离心洗涤2 次，再重悬于1 mL 的染色缓冲液中，最后流式上机检测各组细胞样本中发生去极化的细胞数，并计算细胞比例。其中绿色荧光为去极化细胞，去极化细胞比例越高，提示细胞受损严重，线粒体膜电位下降越严重。

1.4.3 各组大鼠肝组织细胞ATP 水平检测使用ATP 检测试剂盒。准确称取0.5 g 组织样本，匀浆裂解完全后于8 000 r/min 离心5 min，取上清液过滤蛋白后稀释。分别加0、2、4、6、8、10 μL 10 mmol/ L 标准品到96 孔板内，加ATP Assay Buffer 补充至50 μL，另加入50 μL 样本；混合混匀后覆膜，室温避光孵育0.5 h；测量各孔570 nm 波长下的吸光度值。结合标准曲线计算样本ATP 水平。

1.4.4 各组大鼠肝组织线粒体自噬的检测 使用透射电镜观察。新鲜肝脏组织块放入2.5%戊二醛磷酸缓冲液中固定过夜，取出冲洗、固定、染色、脱水、渗透和包埋，置于烘箱内聚合，之后修块并制作超薄切片，染色后置于TECNAI 10 透射电镜下观察线粒体形态和自噬小体。

1.4.5 各组大鼠肝组织IL-1β 阳性率检测 采用免疫组化染色。取新鲜肝脏组织固定、修块、脱水、透明、浸蜡、包埋及切片，使用二甲苯脱蜡，乙醇复水，用3%的双氧水在37 ℃孵化10 min，PBS 冲洗后进行抗原修复，加入一抗后在4 ℃冰箱中孵育过夜，取出后室温下静置30 min，PBS 洗涤3 次，5 min/次；滴加二抗，在37 ℃下孵育40 min，再用PBS 冲洗3 次，5 min/次；用二氨基联苯胺法染色，然后再用苏木素复染，等待其干燥后封片，显微镜下观察肝脏组织IL-1β 阳性率，切片褐色或黄褐色表示为阳性。用Image-Pro Plus 测量免疫组化阳性表达的吸光度值。

1.4.6 各组大鼠血清IL-1β 水平检测 采用ELISA法。设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔加入50 μL 不同浓度的标准品。样本孔中加50 μL 待测样本，空白孔加50 μL 样本稀释液。各孔分别加入100 μL 辣根过氧化物酶标记的检测抗体，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温温育60 min。弃去液体，控干后洗涤液清洗5 次。各孔加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液。测量各孔450 nm波长处吸光度值。根据标准曲线图计算IL-1β 水平。

1.4.7 各组大鼠肝脏组织线粒体自噬相关蛋白和炎症相关蛋白表达的检测 采用Western blot 法。取0.1 mg 肝脏组织加入裂解液，充分匀浆后离心，留存上清液。加入BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测样本中的蛋白浓度，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，再转膜并封闭。取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，加入TBST 缓冲液，摇床上缓慢洗涤5 min。将PVDF 膜移入含有线粒体自噬相关蛋白（Parkin、PINK1）和炎症相关蛋白（NLRP3、Caspase-1和IL-1β）一抗的孵育盒中，4 ℃孵育过夜。洗膜后将PVDF 膜转移到含二抗的抗体孵育盒中，室温下摇床孵育2 h，并再次洗膜。最后将PVDF 膜放于保鲜膜之上，加入底物，并移入凝胶成像分析仪中曝光显影。以βactin为内参，计算各蛋白灰度值，即蛋白表达水平。

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法；方差不齐时用Tamhane 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5 组大鼠肝组织病理学变化 对照组未见明显的肝细胞病变。肝损伤组可见大量肝细胞肿胀，肝小叶结构排列紊乱，中央静脉及肝窦扩张，严重充血，并且可见点状坏死，较多炎症细胞浸润，细胞核深染固缩、碎裂及溶解。与肝损伤组相比，姜黄素组的肝细胞肿胀及点状坏死则显著减少，炎症细胞浸润相对较轻。而3MA 组及姜黄素+3MA 组的肝组织病理与肝损伤组相比无明显变化，见图1（插页）。

图1 5 组大鼠肝组织的病理变化

2.2 5 组大鼠肝细胞MMP 变化和线粒体ATP 水平的比较 和对照组相比，肝损伤组去极化细胞比例显著上升，提示MMP 下降；且线粒体ATP 水平显著下降（P＜0.01），即线粒体受损严重。和肝损伤组相比，姜黄素组去极化细胞比例显著下降（P＜0.01），提示MMP 升高；且ATP 水平显著升高（P＜0.01），即线粒体ATP 合成能力改善。和姜黄素组相比，3MA 组和姜黄素+3MA组去极化细胞比例均显著上升（均P＜0.05），线粒体合成ATP能力均显著下降（均P＜0.01）。见图2。

图2 5 组大鼠肝组织线粒体ATP 水平和线粒体膜电位比较（A：线粒体细胞膜电位的流式细胞图；B：去极化细胞比例；C：细胞ATP 水平）

2.3 5 组大鼠肝脏组织细胞线粒体自噬情况比较透射电镜结果显示，肝损伤组中，线粒体明显肿胀，内部嵴破坏或消失，并可见自噬体形成。姜黄素组中，线粒体损伤较轻，线粒体碎片减少，自噬体的数量增加，并可见自噬体包裹线粒体碎片。3MA 组和姜黄素+3MA 组线粒体结构明显受损，自噬体数量减少。见图3。

图3 透射电镜下各组大鼠肝组织的线粒体及自噬体形态

2.4 5 组大鼠肝组织IL-1β 阳性率和表达的比较 免疫组化染色结果显示，和对照组相比，肝损伤组阳性细胞数及相应吸光值显著上升（P＜0.01），提示肝组织IL-1β 阳性率升高；和肝损伤组相比，姜黄素组阳性细胞数及相应吸光度值显著减少（P＜0.01），提示肝组织IL-1β 阳性率降低；和姜黄素组相比，3MA 组和姜黄素+3MA 组阳性细胞数及相应吸光度值均显著上升（P＜0.01）。ELISA 结果显示，与对照组相比，肝损伤组血清IL-1β 水平显著升高，与肝损伤组相比，姜黄素组血清IL-1β 水平显著下降，与姜黄素组相比，3MA 组和姜黄素+3MA 组血清IL-1β 水平显著下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见图4。

图4 5 组大鼠IL-1β 表达比较（A：肝组织免疫组化染色结果；B：平均吸光度值；C：血清IL-1β 水平）

2.5 5 组大鼠肝组织线粒体自噬相关蛋白和炎症相关蛋白表达的比较 与对照组相比，肝损伤组的Parkin、PINK1、NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 的蛋白灰度值均显著上调（均P＜0.01）；与肝损伤组相比，姜黄素组Parkin 和PINK1 蛋白灰度值显著上调（均P＜0.05），NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白灰度值均显著下降（均P＜0.01）；与姜黄素组相比，3MA 组和姜黄素+3MA 组Parkin、PINK1 蛋白灰度值均显著下降（均P＜0.01），NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 蛋白灰度值均上升（均P＜0.05）。见图5。

图5 5 组大鼠肝组织Caspase-1、IL-1β、NLRP3、Parkin 和PINK1 的蛋白灰度值比较（A：蛋白电泳图；B：蛋白灰度值）

3 讨论

姜黄素是一种药理作用广泛的天然化合物，在近年来受到国内外众多学者的广泛关注。本研究发现，姜黄素可以显著改善LPS/D-GaIN 所致的肝脏病理组织学损伤，姜黄素治疗后，受损的肝脏组织细胞的MMP 可显著升高，线粒体ATP 的合成能力也得到改善，提示姜黄素的肝脏保护作用与其保障线粒体功能相关。然而，在给予自噬抑制剂3MA 后，MMP 和ATP水平均显著下降，提示姜黄素对线粒体功能的保护作用可能与线粒体自噬相关。

线粒体自噬是自噬的一种特异性的选择形式，可以选择性地清除细胞中受损的线粒体，从而维持线粒体功能的完整[10-11]。线粒体自噬通路中一个重要的调节途径是PINK1-Parkin 通路，当线粒体发生去极化损伤时，PINK1 会聚集在线粒体外膜并快速激活Parkin，并将其募集至线粒体外膜，促进线粒体膜蛋白泛素化，从而启动线粒体自噬[12-13]。近年来研究发现，姜黄素对线粒体自噬有着重要调节作用。Wang 等[14]发现姜黄素能通过上调沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRTl）抑制NLRP3 炎症反应，从而减轻急性肺损伤。Rainey 等[15]发现，姜黄素能促进线粒体的生物合成，并诱导线粒体自噬。Cao 等[16]研究认为，姜黄素可通过PINK1-Parkin 通路调控线粒体自噬，从而改善H2O2诱导的肠上皮氧化应激损伤，而敲除Parkin 基因则可消除姜黄素的保护作用。Wang等[17]研究发现，姜黄素可以改善脑缺血再灌注损伤，其机制是姜黄素增加了线粒体膜电位和ATP 水平，从而保护线粒体功能并增强线粒体自噬。

本研究发现，当LPS/D-GalN 引起大鼠肝组织损伤时，线粒体ATP 水平和MMP 下降，电镜下观察到线粒体损伤严重，自噬体数量增多，Western blot 结果显示线粒体自噬相关蛋白PINK1 和Parkin 的表达上调，提示LPS/D-GalN 致肝损伤可激活线粒体自噬，以进行自我保护；姜黄素干预后，大鼠肝组织损伤减轻，线粒体ATP 水平和MMP 上升，电镜下观察到线粒体碎片被自噬体包绕，线粒体损伤减轻，PINK1 和Parkin 的蛋白表达显著增强；然而，当加入自噬抑制剂3MA 后，姜黄素的这种保护作用被逆转，表现为PINK1 和Parkin 的蛋白表达显著减少。这些结果表明，线粒体自噬可能在姜黄素缓解LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤中发挥了保护作用。

LPS/D-GalN 损伤肝脏时会产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），而ROS 是激活NLRP3 炎症小体的重要诱因[18-19]。近年来研究发现，NLRP3 炎症小体在急性肝损伤中发挥重要作用[20-22]。在受到病原体相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）刺激后，NLRP3 炎症小体可活化Caspase-1 分子，继而活化促炎因子IL-1β，进一步激活单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞，分泌多种促炎细胞因子，导致细胞程序性死亡[23-24]。ROS 产生的主要场所是线粒体，线粒体自噬作为一种重要的选择性自噬，可选择性清除受损的线粒体，与炎症反应和炎症小体关系最为密切[7，13，25]。Yu 等[26]研究发现，利拉鲁肽可能通过促进肝细胞中的线粒体自噬，抑制NLRP3 炎症小体的活化，从而减缓非酒精性脂肪性肝炎的进展。Shan等[27]认为，在对乙酰氨基酚导致的急性肝损伤的小鼠模型中，增强线粒体自噬可以抑制NLRP3 炎症小体的激活，从而减轻肝脏炎性反应，改善肝损伤。以上研究中表明，线粒体自噬-NLRP3 炎症小体通路在肝损伤中的作用重大。本研究经免疫组化和ELISA 检测均发现，相比肝损伤组，姜黄素组IL-1β 表达水平显著下降，Western blot 显示炎症相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β 的表达明显下降，提示姜黄素可以抑制NLRP3 炎性小体的活化，减少Caspase-1 和IL-1β 生成，从而减轻炎症反应。但加入3MA 后线粒体自噬蛋白减少，而炎症相关蛋白NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 的表达均显著增强，血清及肝脏组织中IL-1β 含量明显升高，从而验证了线粒体自噬对炎症反应的调控作用。

综上所述，姜黄素对LPS/D-GalN 诱导的急性肝损伤的保护作用可能与激活线粒体自噬抑制NLRP3炎性小体介导的炎症反应相关，但尚需进一步深入研究。