干细胞及其衍生物促进骨结合的应用进展

叶鑫健 姜禾 夏思齐 白怡婧 戴雨薇 陈谦明

口腔种植术是近年来蓬勃发展的一种用于修复缺失牙的临床治疗技术。骨结合指负载的种植体表面与发育良好的骨组织在结构与功能上的紧密结合，是口腔种植的重要理论基础[1]。种植区骨质量不佳和机体骨愈合能力下降是导致种植早期骨结合失败的常见原因，而即刻种植的发展也对早期高强度的骨结合提出了更加严苛的要求[2]。种植体表面生物化学改性是促进骨结合的常用方法，该方法将表达生物活性分子的修饰物固定于种植体表面，以诱导内源性干细胞成骨向分化及成骨细胞的增殖矿化，但当骨代谢受损时修饰效果欠佳[3]。干细胞是一类高度增殖、自我更新的多向分化潜能细胞，具有强大的生物学功能。近年来，随着再生医学与组织工程技术的不断发展，干细胞及其衍生物在口腔颌面部骨再生及修复重建领域的应用潜力逐渐被挖掘，其在促进种植体周骨组织改建和早期骨结合中的作用初露锋芒[4]。一方面，以干细胞及其衍生物为修饰涂层的组织工程化种植体具有良好的生物活性和成骨能力，为种植体表面生物化学改性开辟了新的思路；另一方面，植入具有适当诱导指向性的外源性干细胞及其衍生物能够有效改善受损条件下的骨代谢，有效拓宽种植手术的适应证范围[5]。本文就干细胞及其衍生物在促进骨结合方面的应用进展作一综述，以期推动干细胞治疗在口腔种植术和再生医学领域的进一步研究和应用。

1 应用于骨结合的干细胞类型

1.1 骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs） BMSCs 是骨改建的主响应细胞，因具有多向分化潜能、高增殖能力及低免疫原性等优点，已成为促进骨结合相关研究的主要干细胞类型[6]。Jiang 等[7]研究发现光控BMSCs 片状植入物复合体可促进种植区产生更活跃的骨再生和更牢固的骨结合，从而降低种植体周围愈合不良风险和炎症发生率。BMSCs 是目前应用和研究最为广泛的干细胞类型，临床转化前景也最为广泛。

1.2 牙源性干细胞（dental stem cells，DSCs） DSCs 包括牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、人脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）等类型，可通过微创的方法从离体乳牙、正畸牙或智齿中提取[8]。Cao 等[9]研究表明载有SHEDs 的种植体能够有效改善犬种植体周骨质量，并加速早期骨结合。DSCs 来源丰富且无伦理争议，兼具高增殖能力与分化潜能，其相关临床研究也正在有序开展。

1.3 脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）ADSCs 来源于脂肪组织，具有多向分化潜能[10]。Bressan 等[11]将播种于羟基磷灰石支架的ADSCs 植入犬即刻种植模型后，观察到其具有促进血管、成骨细胞和骨基质形成以及加速种植体周围缺损骨愈合的治疗效果。ADSCs 因取材方便、取材量大、创伤小等优点，已成为近年来的研究热点。

1.4 小造血干细胞（small blood stem cells，SBSCs）SBSCs 源于人外周血、骨髓及脐带血，具有提取率高、可塑性强、耐受性良好等特征，其来源丰富、免疫排斥风险低，非常适用于自体移植[12]。Ou 等[13]研究证实SBSCs 治疗在低密度骨动物模型中具有平衡种植体应力和促进早期骨结合的作用。Sheng 等[14]的Ⅰ期临床试验证实，牙科植入SBSCs 治疗严重骨缺损患者的有效性、安全性和耐受性均十分显著，SBSCs 可抑制骨结合过程中的炎症反应，提高患者术后舒适度，在临床实践中有一定的应用潜力。

2 干细胞局部移植的组织工程应用

干细胞的局部移植利用组织工程化载体将干细胞直接转移至种植体周组织床，以构建利于骨生长的局部微环境与三维分层结构。该应用方式依赖于组织工程学技术的发展，细胞膜片技术、组织工程支架技术等新型技术的开发最大限度地保留了移植过程中的细胞活性，其成骨效益也被应用于引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）术、上颌窦底提升（sinus floor elevation，SFE）术等骨组织增量技术。

2.1 干细胞膜片技术 干细胞膜片技术指将纯化的干细胞与种植体进行体外共培养，在种植体表面构建细胞外基质与致密干细胞片层的活性修饰物[15]。该技术无需蛋白水解酶，减少或避免了移植细胞的破坏及分化表型丧失，外源性干细胞直接增加了种植体表面活性细胞数量，是种植体表面生物化学改性的理想备选方案[16]。先前研究将兔BMSCs 膜片组装附着于种植体表面，从组织学、基因调控和种植体表征等方面证实了其体内外的成血管成骨耦合能力[17]。近年来，使用经基因转染或转录控制的细胞膜片技术通过加强成骨相关基因及信号通路的表达，促进了植入的干细胞成骨向分化，已成为研究热点之一。当前，抗微小RNA（mircoRNA，miRNA）-138 递送和nel 样Ⅰ型基因（nel-like typeⅠgene，nell-1）过表达的BMSCs 细胞膜片均取得了可观的促骨结合效果[18-19]。在2 型糖尿病大鼠[20]、去卵巢骨质疏松大鼠[21]和放疗后大鼠[22]等骨代谢缺陷动物模型中，BMSCs 膜片均展现出改善植入区骨质量、促进种植体周骨组织的愈合再生和加速种植体骨结合的强大潜能，这提示该技术的应用可有效提高临床种植治疗的成功率，尤其在骨状况不佳的情况下。

随着纳米材料的发展，光控细胞片、热响应细胞片、磁控细胞片、活性氧诱导细胞片等膜片制备技术应运而生[23-24]。新型制备技术的发展有望解决细胞膜片离体保存时间短、生物活性损伤、降解缓慢等技术难题[7，25]。

2.2 组织工程支架技术 组织工程支架技术将富含生长因子的高浓度离体干细胞体外移植至可吸收聚合物支架上并回植入组织缺损部位，待支架材料降解后，缺损区被干细胞及其分泌的基质所代替，进而修复、再造和重建缺损组织[26-27]。具有一定机械强度的三维立体支架保障了种植体的初期稳定性，适用于伴有重度骨缺损、牙槽骨萎缩患者的种植或即刻种植[28]。以BMSCs 为种子细胞联合富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）的骨组织生物支架表现出良好的骨再生相容性，被证实具有优化缺损区再生骨质量、提高种植体初期稳定性等作用[29-30]。一项8 年随访的临床研究证实，该类型支架在牙槽骨严重萎缩的种植患者中长期应用同样具有安全性、有效性和稳定性[31]。播种于组织工程支架的ADSCs 在犬即刻种植模型中也表现出促成骨钙化的类似生物学效应[11]。但Stramandinoli-Zanicotti 等[32]在小型猪即刻种植模型中却未检测到BMSCs-PRP 支架促骨结合的显著性积极效应，这可能与植入设计、支架材料、动物模型种类等因素有关。

最新研究发现，生物3D 打印的组织工程支架将种子细胞混入液态高分子材料或水凝胶，组成“生物墨水”[33]，利用影像技术对种植区复杂结构及缺损进行精准设计，实现了对干细胞分布及材料降解速率的有效调控[34]。3D 打印技术能与干细胞移植相辅相成，制造具有更佳形态匹配、机械抗性与生物相容性的组织工程支架[35]。如何达到支架的降解性能、生物力学性能和种子细胞活性的最佳平衡状态是近年来发展的技术难点[36]。

2.3 骨组织增量应用 干细胞移植物的骨增量作用已在动物基础实验中得到证实。有研究发现在兔GBR 术中添加ADSCs 膜片可有效促进骨缺损区新骨形成，并由此推断干细胞植入物可以辅助传统植骨材料或生物屏障膜以提高GBR 术的治疗效能[37]。无独有偶，使用基因转导BMSCs 生物支架行犬SFE 术也取得了类似的促成骨效果[38]。种植区充足的骨量及致密的骨质是形成良好骨结合的必要条件，临床种植手术常需辅以GBR 术和SFE 术等软硬组织增量技术以改善术区骨质量。干细胞的局部移植协同骨组织增量技术具有良好疗效，为骨量不足患者种植手术的开展提供了有利条件[39-40]。一项临床随机对照试验表明BMSCs 自体移植促进了SFE 术中的骨愈合[41]，提示干细胞移植在上颌窦严重萎缩患者的鼻窦重建、颅面骨缺损再生和种植手术中具有广阔的临床应用潜力。

3 干细胞衍生物及其应用

干细胞衍生物是由干细胞释放或分泌到细胞外间质的生物活性成分，包括细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）等[42]。干细胞衍生物通过脱细胞的方法去除了移植物中的细胞成分并保留其功能性产物，降低了移植物的抗原性和免疫排斥风险[43]。但干细胞衍生物并不能直接补充成骨细胞数量，更多起到的是骨诱导的作用。负载于种植体表面的干细胞衍生物可在种植手术产生的骨创伤微环境的诱导下，促使BMSCs 募集及成骨向分化，从而实现良好的骨愈合和早期骨结合[44]。

3.1 干细胞衍生ECM ECM 是细胞内环境中大分子物质所构成的复杂网络结构。ECM 片层在细胞膜片的基础上经脱细胞制备而成，应用于种植体表面可构建适宜BMSCs 成骨向分化的纳米结构与微生化环境[45]。Fu 等[46]研究发现，BMSCs 衍生ECM 包覆在电纺纳米纤维表面可显著增强BMSCs 的黏附增殖和分化成骨能力，与Feng 等[47]在钛种植体表面观察到的变化和体内种植实验结果类似。干细胞衍生ECM 片层有效实现了材料与种植体周围微环境的动态互动，为种植材料表面改性提供了新的策略[48]。此外，以干细胞衍生ECM 为内容物的生物活性支架材料具有高生物活性、生物相容性和易用性，在骨生物工程和组织再生领域取得了较大的进展[49]。

3.2 干细胞衍生EVs EVs 是细胞分泌的异质性脂双层膜性囊泡，其内容物包含丰富的生物学信号，在细胞间信息传递与交流中起到重要作用[50]。装载到种植体表面的包含有成骨生物信号的干细胞衍生EVs 能有效调节BMSCs 血管生成、骨形成与骨改建进程。Ma 等[51]研究发现，负载精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列信号肽的BMSCs 衍生EVs 涂层的钛植入物促进了BMSCs 的成骨分化和矿化，显著增强了种植体骨结合。利用组织工程技术对干细胞衍生EVs 内容物进行人工改造与重构，可靶向输送生物活性因子并调节局部骨代谢[50]。

4 干细胞的全身移植应用

干细胞的全身移植指通过注射或介入治疗的方法将干细胞移植入患者体内，以修复或替换受损组织细胞，是干细胞治疗的传统方式。外源性干细胞直接弥补了受损机体干细胞活性低下及数量不足的缺陷，适用于自发性修复受限的患者[52]。有研究发现，DPSCs 联合神经生长因子腹腔注射能够促进大鼠成骨相关基因表达，提高大鼠种植体周骨小梁密度、数量与厚度，并加速种植体早期骨结合，但全身移植的干细胞常需辅以特定成骨诱导性的生物活性因子，其临床应用的安全性仍有待进一步探究[53]。

糖尿病、骨质疏松症及放疗患者因骨结合受限，被认为是口腔种植的相对或绝对禁忌证，干细胞的全身移植旨在通过调节机体新陈代谢、控制基础性疾病的发展以拓宽临床种植的适应证范围[54]。较局部移植而言，干细胞的全身移植要求更高的移植量，其潜在风险和时间经济成本也会随之提高，目前临床应用仅限于常规种植手术及软硬组织增量技术无法解决的领域，以期使原本无法进行种植修复的情况同样适用种植疗法[55]。

5 小结与展望

干细胞及其衍生物具有强大的促血管成骨耦合等生物学效能，干细胞类型丰富，应用方式多样，可直接或间接应用于促进种植体周围骨愈合和早期骨结合，在骨组织再生领域应用广泛。负载特定干细胞成分的细胞膜片或生物涂层作为种植体表面生物化学改性的新方法，可用来构建兼具成骨活性与低免疫原性的组织工程化种植体。

相较于喷砂、等离子处理、物理气相沉积、激光处理、微弧氧化处理、生物分子吸附等常规种植体表面改性方法，干细胞疗法较好地解决了引导成骨、优化种植体表面、增加生物嵌合等3 者的平衡问题。一方面，外源性引入的具有成骨分化导向的干细胞及其衍生物引导成骨作用显著，直接参与了种植体周围骨改建的生物进程；另一方面，干细胞膜片技术、组织工程支架技术和骨组织增量等新兴组织工程技术的应用为干细胞在种植体表面牢固的生物嵌合提供了保障。此外，干细胞疗法有效改善了局部骨质量或全身机体状态，弥补了内源性干细胞活性低下或数量不足的缺陷，为种植手术的开展扫清了障碍，尤其适用于骨缺损、牙槽骨萎缩、骨质疏松症、即刻种植和放疗后的患者。但需注意的是，现阶段干细胞及其衍生物在口腔种植领域的临床应用推广仍存在一些问题亟待解决。首先，覆盖于种植体表面的涂层修饰物会因种植手术过程中不可避免的摩擦产热导致磨损磨耗、细胞活性降低乃至涂层松动脱落，增加两者结合强度的方法仍待进一步探索；其次，不同集落来源干细胞的表型异质性和生长能力存异，能够产生实质临床效应的最小移植量存在个体差异性且难以预测；再者，外源性干细胞及其衍生物常需辅以成骨导向生物活性因子，其最佳类型、搭载量、释放率及相互作用机制目前尚无定论，待进一步优化以维持移植物的成骨活性与长期稳定性；最后，干细胞研究受到伦理学与法律的严格限制，国内干细胞移植的监管体系尚未成熟，其适应证和禁忌证仍需更加精准的把控。

作为再生医学最具前景的治疗方法之一，干细胞及其衍生物具有很大的临床应用潜力。相信随着组织工程技术的深入和相关政策的完善，干细胞疗法将会取得更大的突破，以更好实现骨组织与种植体之间持久、牢固而直接的骨结合，为种植患者带来福音。