自身免疫性溶血性贫血患者类抗-D抗体的鉴定及输血治疗（附1例报告）

王加勇，丁懿，陆紫敏

同济大学附属同济医院输血科，上海 200065

输血在救治自身免疫性溶血性贫血（AIHA）患者过程中起关键作用，但AIHA患者血清中存在自身抗体，多数自身抗体缺乏特异性，会和所有供者的红细胞发生凝集反应，在交叉配血时掩盖同种抗体，易造成误诊［1］。少部分自身抗体具有特异性，兼有同种抗体和自身抗体特性，可与表达相应抗原的红细胞发生反应，引起溶血反应，这类自身抗体称为类同种抗体，简称类抗体［2］。临床输血检测中类抗体较少见，血清学试验很难区分抗体性质，常会造成临床漏诊，给输血安全带来较大风险［3］。血清学检测联合基因型分析可检出未知的类抗体，输血治疗时选择类抗体相应抗原阴性的红细胞，能最大限度地减少患者同种免疫的发生和溶血反应，保障临床输血安全［4］。本研究使用血清学检测和聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法处理了1例类抗-D抗体AIHA患者，拟通过回顾性分析患者的病例资料，总结其血清学检测和基因分型处理方法，指导临床安全用血。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取同济大学附属同济医院血液内科2022年7月17日收治的AIHA患者为研究对象，本研究经医院伦理委员会批准（审批编号：2019-YLJS-016），患者签署知情同意书。患者女，46岁，汉族，因头晕、乏力1周伴茶色尿，门诊以“溶血性贫血”收治入院。患者在外院确诊自身免疫性溶血性贫血2年半，重度贫血貌，皮肤巩膜黄染，气促明显，心率119次/分，显著增快。实验室检查：Hb 32 g/L，红细胞（RBC）计数0.89×1012/L，网织红细胞（Ret）绝对值621×109/L，总胆红素（TBIL）126.3 μmol/L，间接胆红素（IBIL）102.7 μmol/L，血小板计数（PLT）72×109/L，患者红细胞有破坏现象，重度贫血，临床申请输注去白红细胞悬浮红细胞4 U。

1.2 血型免疫血清学检测

1.2.1 ABO、RhD血型鉴定 ABO/RhD血型鉴定采用微柱凝胶卡法，RhD基因分型、DAT采用试管法，实验操作均按照标准操作规程执行［5］。

1.2.2 不规则抗体筛查和鉴定 不规则抗体筛查和抗体鉴定谱细胞检测采用微柱凝胶卡法。采用吸收放散试验鉴定不规则抗体，选择B型RhD阴性的献血员红细胞，用生理盐水洗涤3次，取1 mL压积红细胞，加入等量患者血清，充分混合后37 ℃孵育2 h，分离上清液测定血清抗体效价；吸收后的红细胞用生理盐水洗涤3次，加入等量乙醚放散，分离放散液进行抗体鉴定。

1.2.3 交叉配血试验 交叉配血联合采用盐水试管法、聚凝胺法和抗球蛋白柱凝集法。

1.3 ABO、RhD血型基因分型判断 采用PCR-SSP法。采集患者新鲜EDTA抗凝静脉全血2 mL，用核酸提取或纯化试剂从全血中提取DNA 100 μL，采用紫外分光光度计检测DNA含量为20.58 ng/μL，A260/A280为1.78。采用PCR-SSP法检测ABO血型基因和RhD基因，ABO血型基因分型PCR反应体系总体积120.9 μL，其中0.9 μL Taq酶（5 U/μL），10 μL DNA，110 μL dNTP-Buffer工作液，分别向人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒的引物孔（1～11孔）中各加入10 μL上述混合液，调整好反应程序，置Life ECO型PCR仪上进行扩增。PCR反应条件：96 ℃预变性2 min，进入循环扩增阶段，96 ℃ 20 s、68 ℃ 60 s循环5次；96 ℃ 20 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s循环10次；96 ℃ 20 s、62 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s循环15次；72 ℃3 min；最后在4 ℃条件下保存。RhD基因分型PCR反应体系总体积90.8 μL，其中0.8 μL Taq酶（5 U /μL），10 μL DNA，80 μL dNTP-Buffer工作液，分别向人类红细胞RhD基因分型试剂盒的引物孔（1～8孔）中各加入10 μL上述混合液，调整好反应程序，置Life ECO型PCR仪上进行扩增。PCR反应条件：在96 ℃预变性2 min，进入循环扩增阶段，96 ℃ 20 s、68 ℃ 60 s循环5次；96 ℃ 20 s、65 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s循环10次；96 ℃ 20 s、62 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s循环18次；72 ℃ 5 min；最后在4 ℃条件下保存。将PCR产物转移至2.5%琼脂糖凝胶孔中，JY300C核酸电泳仪电泳15 min，在JYO2S核酸成像分析仪下观察条带结构，依据结果分型表判断血型检测结果。

2 结果

2.1 ABO、RhD血型鉴定与不规则抗体筛查 患者ABO血型鉴定结果见表1，正定型结果为AB，反定型结果为O型，试管法反定型在显微镜下可见Bc、Oc和自身红细胞均凝集，加生理盐水后凝集未散开，正反定型结果不一致；患者RhD血型是DCCee。患者血浆与抗体筛查细胞Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均凝集，不规则抗体筛查结果见表2。患者红细胞做DAT结果为抗IgG+C3阳性（3+），抗IgG阳性（2+），抗C3阳性（+）。

表1 患者ABO血型鉴定正反定型结果

2.2 ABO、RhD血型基因分型 ABO基因分型结果显示患者基因型为BO1，表型为B型。RhD基因分型结果显示患者基因分型为RhD阳性。

2.3 抗体鉴定 患者血清及放散液与抗体鉴定谱细胞反应格局见表3。对照谱细胞试剂盒（批号20220105）抗原格局表，抗体鉴定符合抗-D格局，红细胞血型抗体鉴定细胞反应格局表见表4。患者血清与11号谱细胞反应效价为1∶4。

表3 患者血清及放散液与抗体鉴定谱细胞反应格局

表4 红细胞血型抗体鉴定细胞反应格局表

2.4 吸收放散试验 吸收后上清液测定血清抗-D抗体效价为阴性，吸收后放散液进行抗体鉴定，与抗体鉴定谱细胞反应格局符合抗-D抗体特异性，与11号谱细胞反应效价为1∶4，患者血清类抗-D抗体被RhD抗原阴性红细胞吸收。

2.5 交叉配血 患者标本与4单位B型RhD抗原阴性的红细胞做交叉配血试验，主侧在盐水介质（室温、37 ℃）中均有弱聚集，无溶血；主侧在在聚凝胺和抗球蛋白卡中均有弱聚集，无溶血。患者当天输注上述4 U去白红细胞悬浮红细胞后，Hb由输血前32 g/L上升到56 g/L，RBC由输血前0.89×1012/L上升到1.72×1012/L，证明输血有效。

2.6 治疗结局 本例患者采用糖皮质激素作为一线治疗，采用甲泼尼龙20 mg/（kg·d）冲击治疗联合免疫球蛋白（IVIG）1 g/（kg·d）静脉滴注，连用5 d后，口服泼尼松2 mg/（kg·d）至7月27日，患者Hb上升至62 g/L，一般状况良好，准予出院。出院后患者继续口服泼尼松，1个月后逐渐减低激素剂量，总疗程为3个月。患者血清与抗体鉴定谱细胞反应格局随访结果见表5。

表5 随访患者血清与抗体鉴定谱细胞反应格局

3 讨论

类抗体具有红细胞同种特异性抗体性质，同时又具备自身抗体特点，能被该特异性抗原阴性的红细胞吸收，与血型表型相矛盾，在血型系统中，最常见的是Rh血型系统特异性的自身抗体［6］。正常情况下，由于免疫系统具有免疫自稳、免疫监视和免疫防御功能，患者体内不会自发产生类抗体，AIHA患者产生类抗体的发病机制尚不明确，目前一般认为是一种自身抗体-自我免疫现象［7］。AIHA患者的输血是临床治疗中的一大难题，开展血型基因分型检测，与血清学鉴定技术相结合，鉴定出AIHA患者体内存在的类抗体，可以保证临床输血的安全性和有效性。

本研究患者血型鉴定正反定型不一致，反定型试管法Bc、Oc和自身红细胞在不同温度条件下凝集强度一致，排除是冷凝集素干扰［8］，加1滴生理盐水混匀，在显微镜镜下观察凝集未散开，排除是血浆蛋白异常引起的假凝集［9］。患者DAT表现为阳性，抗IgG+C3凝集强度为3+，患者血浆与抗体筛查细胞Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均凝集，凝集强度为2+，较DAT弱，考虑患者有游离自身抗体，不能排除同种抗体存在［10］，患者正定型中红细胞与抗⁃A发生弱凝集，反定型中与正常人的A1红细胞发生凝集，与A亚型的血清学典型特征类似［11］，为排除自身抗体干扰和A亚型，本研究采用PCR-SSP法检测血型基因。

本研究患者ABO基因分型为BO1，表型为B型，排除ABO亚型。患者血清与抗体鉴定谱细胞反应，自身抗体的凝集强度有反应格局，患者红细胞用乙醚放散，用抗体鉴定谱细胞对放散液进行血型特异性鉴定，放散液与所有谱细胞均凝集，且与RhD表型抗原的谱细胞凝集强度更强，反应格局符合抗-D抗体特异性，但由于患者RhD基因分型为RhD阳性，表达正常的D抗原，因此，患者体内产生的抗-D抗体为同种特异性自身抗体。吸收放散试验进一步验证了患者血清类抗-D抗体可被RhD抗原阴性红细胞吸收，符合类特异性自身抗体特征。本研究筛选了RhD抗原阴性的4U去白红细胞悬浮红细胞，给患者输注后，Hb由输血前32 g/L上升至56 g/L，RBC由输血前0.89×1012/L上升至1.72×1012/L，输血有效。临床案例报道类抗体在治疗期间效价下降，在体内存留时间通常为5~10 d，本例患者在入院第10天鉴定抗体特异性，血清与抗体鉴定谱细胞反应已无明显特异性，说明类抗体自身的效价减退，临床治疗有效［12］。

本研究采用PCR-SSP法对患者血型基因精准分析，综合血清学试验对抗体进行特异性鉴定，吸收放散试验结果证实了患者体内存在类抗-D抗体这一结论。要引起重视的是，AIHA患者进行抗体检测时，不能简单地使用“阴性排除法”，认为患者红细胞上存在某抗原，其血浆中就应排除针对该抗原的抗体，不再做进一步检测，这通常会导致有临床意义的类抗体漏检。因此，对于抗体鉴定困难的AIHA患者，进行抗体检测时，可采用PCR-SSP法基因分型辅助鉴定抗体特异性，从而为患者提供精准的输血治疗，为临床输血安全提供保障。

目前，对于类抗体AIHA患者的输血原则国内无明确输血指南。本研究患者输血前Hb 32 g/L，出现明显溶血表现，通过临床评估，选择RhD阴性的去白细胞悬浮红细胞进行输血治疗，输血后Hb升高明显，无输血不良反应。对于AIHA患者类抗体的治疗，也无统一国际标准，多以治疗原发病为主，糖皮质激素是首选。本例患者接受甲泼尼龙20 mg/（kg·d）冲击治疗，联合免疫球蛋白（IVIG）1 g/（kg·d）静脉滴注，连用5 d后，口服泼尼松2 mg/（kg·d），患者溶血得到有效控制，出院后持续激素治疗，3个月后随访，患者自身抗体阴性，治疗有效。

综上所述，血清学检测联合基因分型可鉴定具有同种抗体特异性的自身抗体，类抗体AIHA患者治疗首选糖皮质激素，危急情况下需要输血治疗时，应选择类抗体相应抗原阴性的红细胞，输血效果较好。