低分子量肝素对糖尿病肾病足细胞损伤的影响及机制

王淮淮，赵学慧，王会芳，魏晓岩，贾军利

河北北方学院附属第二医院肾内科，河北张家口 075000

糖尿病肾病（DN）是1型糖尿病（T1DM）和2型糖尿病（T2DM）的常见并发症［1］。糖尿病由多种因素造成，包括高血糖水平、晚期糖基化终产物和肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）的激活［2］。糖尿病早期会出现肾小球肥大、肾小球基底膜增厚、足细胞数量减少、系膜基质扩张和肾小管损伤，在晚期，肾脏会出现肾小球硬化和肾小管间质纤维化，严重时肾功能丧失［3］。目前糖尿病患者依然采用严格的血糖控制和降压降脂治疗，但不能完全阻止患者的肾病进展［4］。肝素类药物是应用广泛的一类抗凝类药物，包括未分级肝素及低分子量肝素（LMH）。LMH是由未分级肝素解聚而得［5］，肝素具有多种药理活性，包括抗凝血抗血栓、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、促进伤口愈合、预防和治疗贫血等［6］。目前LMH治疗DN的相关实验研究较少。2021年12月—2022年11月，本实验采用高浓度葡萄糖（HG）诱导人肾小球足细胞（HGPC）建立DN损伤模型，通过核转录因子-κB（NF-κB）信号通路变化探讨LMH对DN足细胞损伤的保护作用，以期了解DN中足细胞损伤机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株HGPC购自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。低分子量肝素钠（纯度≥99%）、D-葡萄糖、NF-κB通路抑制剂BAY11-7082（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；NF-κB通路激活剂Prostratin购自美国Sigma公司；胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；无糖DMEM培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Hoechst 33258染色试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；TNF-α、IL-6酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；细胞计数（CCK-8）试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；RI‐PA裂解液、0.1 %结晶紫水溶液购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白试剂盒购自英国Abcam公司；鼠抗人肌动蛋白（β-actin）、NF-κBp65、磷酸化（p）-NF-κBp65、波形蛋白（Vimentin）、纤连蛋白（FN）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、上皮型钙黏蛋白（E-cad‐herin）一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗购自美国CST公司。NIKON Ti-s型倒置荧光显微镜购自东莞市昱和仪器设备有限公司，酶标仪购自美国Thermo公司，OI 1000型凝胶成像系统购自上海山科学仪器有限公司。

1.2 HGPC培养 HGPC细胞接种于含10 % FBS、5 mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基中，并置于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养，待细胞贴壁达80 %以上时进行细胞传代，选取对数期细胞用于后续实验。在实验开始之前，用无血清、无糖DMEM培养液在培养箱中培养细胞24 h，使细胞完成同化。

1.3 细胞分组与给药 HGPC细胞同化后调整密度为2×105/mL，接种到合适细胞培养板中。将HGPC细胞分为对照（NC）组、HG组、1、5、10、15、20 μmol/L LMH组，NC组细胞以含5 mmol/L葡萄糖的培养基培养；HG组细胞以含30 mmol/L的葡萄糖培养基培养［7］；1、5、10、15、20 μmol/L LMH组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+不同浓度（1、5、10、15、20 μmol/L）LMH的培养基共同培养，筛选出最佳浓度LMH后，又将细胞分为NC组、HG组、LMH组、BAY11-7082组、LMH+BAY11-7082组、LMH+Pros‐tratin组。LMH组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15 μmol/L LMH的培养基共同培养；BAY11-7082组细胞以含30 mmol/L的葡萄糖+1 μmol/L BAY11-7082的培养基培养［8］；LMH+BAY11-7082组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15 μmol/L LMH+1 μmol/L BAY11-7082的培养基培养；LMH+Prostratin组细胞以含30 mmol/L葡萄糖+15 μmol/L LMH+20 μmol/L Prostratin的培养基培养［9］，实验重复3次并设3个复孔。

1.4 HG诱导的DN模型HGPC细胞活力检测 采用CCK-8法。将细胞以7×103细胞/孔的密度接种于96孔微孔板中。经HG诱导建立模型24 h后，给予不同浓度（1、5、10、15、20 μmol/L）的LMH处理24 h或48 h。显微镜下评估细胞的生长状态，之后使用CCK-8法检测细胞活力，每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，在37 °C孵育1 h后，在450 nm波长下使用酶标仪测量光密度（OD）。

1.5 HG诱导的DN模型HGPC细胞凋亡率检测 采用Hoechst 33258染色法。给药LMH处理24 h后，用10 μL Hoechst 33258染色液在避光条件下染色10 min，固定后在荧光显微镜下（×20）观察并采集Hoechst 33258染色的细胞。细胞凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总的细胞数）×100%。

1.6 HG诱导的DN模型HGPC细胞的侵袭能力检测 取各组处理24 h的细胞，用无血清培养基将细胞制成细胞悬液。Transwell小室预先用基质胶包被，将Transwell小室放入24孔板中，将200 μL（含5×104个细胞）细胞悬液加入Transwell上室，下室加入含有10% FBS的完全培养基，将整个Transwell-细胞体系转至细胞培养箱中继续培养24 h。之后，下室细胞用4%的甲醇固定30 min。之后0.1 %结晶紫染色10 min，将小室放在显微镜下（20×）观察拍照，并分析计算侵袭细胞数（个）。

1.7 HG诱导的DN模型HGPC细胞裂解液中肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6检测 采用ELISA法。评估HG诱导下的HGPC细胞因子分泌水平，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测HGPC细胞裂解液中TNF-α、IL-6。

1.8 HG诱导的DN模型HGPC细胞中NF-κBp65、p-NF-κBp65、Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin表达检测 采用蛋白免疫印迹法。取各组干预24 h后的细胞，与RIPA裂解液共同孵育，并置冰上裂解，12 000 r/min离心20 min（离心半径8 cm），取上清液，其中蛋白质浓度通过BCA蛋白试剂盒来定量分析。按照20 μg/孔的蛋白量上样，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分离蛋白，一抗(稀释比例：NF-κBp65 1∶2 000、p-NF-κBp65 1∶1 000、Vimentin 1∶20 000、FN 1∶5 000、N-cadherin 1∶5 000、E-cadherin 1∶5 000、β-actin 1∶10 000）4 ℃孵育过夜、二抗（稀释比例为1∶2 000）室温孵育2 h，置于凝胶成像系统下显色拍照记录，之后使用Image J（Version 1.53c）软件分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，目的蛋白的相对表达以目的蛋白与β-actin灰度值的比值表示，磷酸化蛋白的相对表达以磷酸化蛋白与非磷酸化蛋白的比值表示。

1.9 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用Dunnett′st检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度LMH对HG诱导DN模型HGPC细胞活力的影响 HG组相比NC组细胞活力下降（P<0.05），在LMH处理24 h或48后，与HG组相比，LMH在1~20 μmol/L时的细胞活力均高于HG组（P均<0.05），且在1~15 μmol/L范围内，HGPC细胞活力随LMH浓度的升高而升高，在浓度为20 μmol/L时相比15 μmol/L稍有下降，后续实验选用15 μmol/L作为LMH的最适剂量。见表1。

表1 各组细胞活力比较（）

表1 各组细胞活力比较（）

注：与NC组比较，*P<0.05；与HG组比较，#P<0.05。

组别NC组HG组1 μmol/L LMH组5 μmol/L LMH组10 μmol/L LMH组15 μmol/L LMH组20 μmol/L LMH组48 h 0.362 ± 0.030 0.238 ± 0.044*0.418 ± 0.035#0.423 ± 0.029#0.466 ± 0.028#0.558 ± 0.026#0.533 ± 0.043#OD值24 h 0.343 ± 0.035 0.206 ± 0.027*0.341 ± 0.027#0.366 ± 0.025#0.463 ± 0.029#0.497 ± 0.034#0.492 ± 0.020#

2.2 LMH和BAY11-7082、Prostratin对HG诱导的DN模型HGPC细胞凋亡的影响 药物处理24 h后，NC组、HG组、LMH组、BAY11-7082组、LMH+BAY11-7082组、LMH+Prostratin组细胞凋亡率分别为（6.380 ±0.840）%、（40.351 ± 2.090）%、（23.285 ± 2.635）%、（20.654 ± 2.299）%、（8.373 ± 2.664）%、（31.738 ±1.442）%，与NC组相比，HG组细胞凋亡率升高（P<0.05）；与HG组相比，LMH组和BAY11-7082组细胞凋亡率下降（P均<0.05）；与LMH组相比，LMH+BAY11-7082组细胞凋亡率下降（P<0.05），LMH+Prostratin组细胞凋亡率升高（P<0.05）。

2.3 LMH和BAY11-7082、Prostratin对HG诱导的DN模型HGPC细胞侵袭能力的影响 处理细胞24 h后，NC组、HG组、LMH组、BAY11-7082组、LMH+BAY11-7082组、LMH+Prostratin组侵袭细胞数分别为（73.333 ± 12.423）、（392.333 ± 37.099）、（178.333 ± 20.817）、（141.667 ± 17.098）、（99.333 ±5.132）、（310.667 ± 35.233）个/HP，HG组和NC组相比侵袭细胞数上升（P<0.05）；与HG组相比，LMH组和BAY11-7082组侵袭细胞数少（P均<0.05）；与LMH组相比，LMH+BAY11-7082组侵袭细胞数少（P<0.05），LMH+Prostratin组侵袭细胞数多（P<0.05）。

2.4 各组HGPC细胞裂解液中TNF-α、IL-6分泌水平比较 与NC组相比，HG组TNF-α、IL-6水平升高（P均<0.05）；与HG组相比，LMH组和BAY11-7082组TNF-α、IL-6水平下降（P均<0.05）；与LMH组相比，LMH+BAY11-7082组TNF-α、IL-6水平下降（P均<0.05），LMH+Prostratin组TNF-α、IL-6水平升高（P均<0.05）。见表2。

表2 各组HGPC细胞裂解液中TNF-α、IL-6水平比较（pg/mL，）

表2 各组HGPC细胞裂解液中TNF-α、IL-6水平比较（pg/mL，）

注：与NC组相比，*P<0.05；与HG组相比，#P<0.05；与LMH组相比，&P<0.05。

IL-6 1.559 ± 0.232 12.486 ± 0.447*6.287 ± 0.168#5.672 ± 0.223#3.307 ± 0.272&9.805 ± 0.223&组别NC组HG组LMH组BAY11-7082组LMH+BAY11-7082组LMH+Prostratin组TNF-α 2.676 ± 0.067 8.351 ± 0.183*5.704 ± 0.133#4.540 ± 0.133#3.468 ± 0.351&6.503 ± 0.285&

2.5 各组HGPC细胞中NF-κB通路相关蛋白p-NF-κBp65表达比较 NC组、HG组、LMH组、BAY11-7082组、LMH+BAY11-7082组、LMH+Prostratin组p-NF-κBp65相对表达量分别为1.295 ± 0.120、1.922 ± 0.034、1.229 ± 0.080、1.099 ± 0.062、0.449 ± 0.006、1.839 ± 0.028。与NC组相比，HG组细胞中p-NF-κBp65表达升高（P<0.05）；与HG组相比，LMH组和BAY11-7082组细胞中p-NF-κBp65表达下降（P均<0.05）；与LMH组相比，LMH+BAY11-7082组细胞中p-NF-κBp65表达下降（P<0.05），LMH+Prostratin组细胞中p-NF-κBp65表达升高（P<0.05）。

2.6 各组HGPC细胞中Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达比较 见表3。

表3 各组HGPC细胞中Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达比较（）

表3 各组HGPC细胞中Vimentin、FN、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达比较（）

注：与NC组相比，*P<0.05；与HG组相比，#P<0.05；与LMH组相比，&P<0.05。

组别NC组HG组LMH组BAY11-7082组LMH+BAY11-7082组LMH+Prostratin组E-cadherin蛋白1.065 ± 0.017 0.553 ± 0.008*0.871 ± 0.009#0.841 ± 0.019#1.166 ± 0.003&0.531 ± 0.008&Vimentin蛋白0.428 ± 0.024 0.870 ± 0.075*0.578 ± 0.028#0.506 ± 0.028#0.192 ± 0.004&0.812 ± 0.019&FN蛋白0.515 ± 0.021 0.777 ± 0.006*0.544 ± 0.025#0.524 ± 0.012#0.302 ± 0.005&0.741 ± 0.021&N-cadherin蛋白0.621 ± 0.021 0.935 ± 0.037*0.580 ± 0.041#0.479 ± 0.040#0.266 ± 0.020&0.881 ± 0.015&

3 讨论

DN是糖尿病患者死亡的主要危险因素，是终末期肾病肾衰竭的主要原因［10］。随着DN发展，肾小球受损数量增加，肾小球滤过能力降低。研究表明，DN发生、发展与足细胞损伤相关［11］。足细胞是一种独特的、高度分化的肾小球上皮细胞，与内皮细胞和基底膜一起形成肾小球滤过屏障，维持肾脏正常功能。DN足细胞损伤后其形态学发生较大改变，包括足细胞肥大、足细胞上皮间质转化（EMT）和足细胞凋亡［12］。

高血糖、氧化应激和RAAS系统激活是造成DN损伤的主要致病因素，但现有大量证据表明，炎症在糖尿病发生、进展中起关键作用［13］，且调节炎症反应已成为治疗DN的一种潜在方案［14］。研究发现，TNF-α主要由活化的单核/巨噬细胞产生，促进细胞增殖和分化，是重要的炎症因子［15］，且与糖尿病患者的蛋白尿发生密切相关，表明TNF-α是糖尿病神经病变的潜在预后生物标志物［16］。IL-6是一种细胞因子，在炎症病理学中起关键作用。研究发现，DN患者尿液中IL-6水平升高［17］，而阻断IL-6受体后，通过减少炎症和氧化应激，减弱了糖尿病大鼠的组织病理学改变［18］。NF-κB参与细胞对外界刺激的响应，在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中发挥关键作用。研究表明，抑制NF-κB活性可改善小鼠白蛋白尿、肾小球损伤和血糖水平［19］，并降低肾脏促炎细胞因子水平和氧化应激［20］。本研究发现，LMH可抑制HG诱导的DN模型HGPC细胞凋亡，抑制炎症因子TNF-α和IL-6分泌，抑制NF-κBp65的活化，但并不影响NF-κBp65表达。

EMT是一个可逆过程，其中上皮细胞失去其特性并成为间充质细胞，细胞黏附分子和细胞骨架的表达发生改变。结果，细胞发展运动侵入性，允许它们以高度动态和可塑的方式在上皮和间充质状态之间过渡［21］。EMT是促进细胞迁移和侵袭的因素。足细胞EMT被认为在DN发展中起重要作用，足细胞EMT的靶向抑制可能为DN提供了一种新的治疗方法。本研究发现，LMH可上调HG诱导的DN模型HGPC细胞E-cadherin蛋白表达，抑制Vimentin、FN、N-cadherin蛋白表达，抑制HGPC细胞的侵袭能力。

综上所述，LMH可对HG诱导的DN模型HGPC细胞损伤产生一定保护作用，其机制可能是抑制NF-κB通路的活性和EMT进程。