安全套遗留微量物证分析研究进展

陈麒全

（中国刑事警察学院法化学系,沈阳 110035）

在过去的十年中,性侵案件中使用安全套的比例有所增加[1],导致在很多性侵案件中难以提取到生物样本,因此对安全套使用痕迹的检验成为证据的关键。20世纪20年代,伯克菲尔德是第一个提出对安全套遗留痕迹进行法庭证据研究的人,安全套使用痕迹是确定罪犯主体的关联证据[2]。迄今为止,对性润滑剂和润滑安全套的研究还是针对其主要成分的定性分析。市场上安全套润滑剂有多种配方,但是因为配方候选成分受到国际规范的限制,所以大幅减少了目标物的范围。安全套润滑剂通常是甘油、聚乙二醇(PEG)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或某种食用油。润滑剂在安全套中普遍存在,通常对润滑剂进行鉴别或鉴定,而安全套中的一些次要成分,如香料、麻醉剂或杀精剂,可作为辅助分析物。

笔者将从以下5个方面对避孕套使用痕迹的分析方法进行综述：（1）样品制备；（2）显微镜分析；（3）光谱分析；（4）色谱分析；（5）质谱分析。

1 样品制备

样品制备是进行分析的关键步骤。分析的质量和结果的可靠性在很大程度上取决于该阶段。因此,需要考虑目标化合物、分析方法,是否需要从载体中提取物质分子,或能否进行现场样品分析。

1.1 提取程序

阴道拭子通常使用棉签采样,最合适的萃取方法是固液萃取。固液萃取有几种形式,从简单的技术（煎煮、浸渍、浸泡）到更复杂的技术,如索氏萃取或超临界流体萃取都有被使用。

相关论文阐述了具体的浸渍过程[3]。将拭子放入小瓶中,然后用提取溶剂浸泡。为了提高提取率,小瓶要经过几个常见步骤：超声处理、涡流混合或离心。1988 年,Fujimoto 建议将含有聚硅氧烷的润滑油溶解在丙酮中并用乙醇沉淀有机相[4]。Keil 等[5]在2003年使用乙酸乙酯、乙醚和氢氧化铵缓冲液的混合物稀释拭子,也可以通过蒸发提取溶剂进行浓缩。

提取溶剂的选择取决于目标化合物。在极性溶剂中,甲醇和水是文献中最常用的溶剂,分别占报道方法的16%和11%。在不到5%的研究中使用了其它常见的极性溶剂（例如乙腈或乙醇）。在非极性溶剂的情况下,文献中描述的13%的研究使用己烷和二氯甲烷,另有10%的研究报告使用氯仿。

2001 年,Maynard 等[6]测试了8 种不同的溶剂,以确定哪种溶剂最适合提取目标化合物（PDMS 的非极性溶剂；PEG 和壬醇的极性溶剂）。通过在提取前后称量拭子来研究提取效率,最后得出的实验结果为建议用己烷萃取非极性化合物,用甲醇萃取极性化合物。

1.2 现场分析制样

现场分析的难点在于直接在载体上检测目标物质,从法庭科学的角度来说,现场分析有以下两个优势：（1）无需将微量物质与其载体分离,降低失去目标化合物的风险（特别是在物质量很微小的情况下）；也无需稀释目标物质,导致低于仪器的检测限度。（2）不需要进行提取步骤,可以缩短分析时间,不需要考虑样品或提取物的存储问题。

安全套使用痕迹的现场分析情形较少。Coyle和Anwar 在关于拉曼光谱分析的文章中有所涉及[7]。质谱分析也同样适用,特别是当分析方法允许分析物从其载体上直接解吸时（包括解吸电喷雾电离质谱或硅上解吸/电离质谱）[8‒10]。

还有人使用棉签采样涂抹在显微镜载玻片上分析,通常算作显微镜分析,但可以归类为现场分析的一种形式,它存在物质转移,但没有完整的提取过程。Keil 等[5]针对固体颗粒用此方法制成样品并进行观察。

2 显微镜分析

自20世纪90年代以来,光学显微镜和扫描电子显微镜(SEM)被用于分析避孕套的固体颗粒,这在确定安全套使用痕迹方面起到重要作用[1]。

在一项相关研究中,使用了一批样本用于显微镜调查安全套上的固体颗粒。使用溶剂溶解[11]或涂抹[8]的方法提取颗粒均检测到了淀粉,并观察到至少4种不同的颗粒混合物[5]。文献称淀粉/滑石粉混合物的检测限为0.2%(质量分数)[11]。

显微镜应用于案例研究,在实际样品中发现了大量的玉米淀粉[5]。血红素-伊红染色是一种将细胞染色为粉红色的方法,它可以更好地将未着色的固体颗粒从粉红色上皮细胞中区分出来[5]；Lugol溶液(I2KI)也可以用于玉米淀粉的可视化,碘与多糖的结构相互作用,并将其染成蓝色以助于区分固体颗粒。

3 光谱分析

光谱法是最常用的安全套遗留物质分析方法,特别是用于安全套润滑剂和杀精剂的分析。由于光谱方法没有破坏性,光谱检查通常在分析最开始时进行。

3.1 傅里叶变换红外光谱法

红外光谱是鉴定和研究聚合物结构的公认方法[12‒13]。就安全套遗留物质而言,红外光谱的目标化合物主要是润滑剂,也可以用于分析杀精剂。

文献[14]用傅里叶变换红外光谱（FTIR)法对一批样品安全套和私处润滑剂进行分析,检测到痕量的聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚乙二醇（PEG）和壬苯醇醚-9。FTIR法有时还会发现其它化合物,如未指定的添加剂或苯并卡因[15]。它还有证明是否存在环状或线性硅氧烷以及其相对数量的能力[16]。

FTIR 光谱可在漫反射(DRIFTS)或衰减全反射（ATR）模式下进行检测。Maynard等[6]认为DRIFTS方法优于ATR,因为它允许分析液态提取物并具有更高的光谱质量。考虑到可以检测到PEG 之间的微小差异,存在根据润滑剂的粘度区分安全套品牌的可能性[1]。Blackledge[17]建议通过粘度对含有PDMS 的样品进行分类,使用傅里叶自反卷积法分离位于相同吸收区(约800 cm-1)的两个峰(二甲基和三甲基)。以这两个峰之间的相对丰度比率表示粘度,可以将样品分为不同的类别。大多数安全套属于“200 cSt”类。有相关的数据库已在我国台湾地区建立,但这种方法可能缺乏识别能力。FTIR主要用作筛选方法[6],也用于确认利用拉曼光谱或质谱等方法获得的结果。

应用于模拟案例,发现阴道分泌物和PDMS 之间不存在干扰[1,6]。PDMS 存在于极性提取物中,会对极性化合物产生干扰[6]。当精子存在时,会出现稀释效应,影响PDMS的检测。

3.2 拉曼光谱法

拉曼光谱是检测安全套遗留物质的一种新方法。该方法可用于分析固体颗粒、润滑剂和壬苯醇醚-9[18]。其中大多数研究都集中在润滑剂(PDMS/PEG)分析上。

拉曼光谱能够分析PDMS、PEG 和壬苯醇醚-9的标准物或混合物［18］。PDMS和壬苯醇醚-9主要根据C—H 拉伸带来区分,两种化合物表现出不同的特性。

在对样本进行分析时,有时会观察到荧光,可能是因为芳香添加剂所导致。安全套按照润滑剂可至少分为三类（PDMS、PEG和其它润滑剂）[7]。使用主成分分析（PCA）的化学计量模型强调了区分不同品牌安全套的可能性,但无法区分同一品牌内的样品。

在模拟案例中,未观察到阴道基质和目标化合物之间的干扰[7]。在进行现场拉曼分析之后的DNA分析显示目标化合物并没有因为先前的分析而分解。

3.3 核磁共振法

核磁共振(NMR)波谱是一种分析聚合物非常有效的方法,尤其是分析聚硅氧烷,有专门的硅核磁共振技术进行分析[13]。在安全套遗留物质检测方面,NMR 法分析的目标物质主要是润滑剂（PDMS/PEG）和壬苯醇醚-9。

根据PDMS和壬苯醇醚-9的分析标准,NMR技术对这些化合物体现出非常好的灵敏度,约为0.04 μg/g[19],可检测到低聚壬苯醇醚-9,分析结果与通过高效液相色谱法获得结果一致[20]。可在样品中检测到PDMS,并且可以估计环状和线性硅氧烷之间的比率。过少量的物质和在不同介质中对PDMS的稀释效应不会妨碍分析和检测。

利用固态C13-NMR 检测润滑剂和乳胶,H1-NMR检测其它化合物[21],可以根据安全套的物理性质（颜色、气味等）和核磁共振谱分析结果区分不同类型的安全套[21],在实验室中的准确率可以达到0.98,但尚未应用于实际案例中。

4 色谱分析法

气相色谱法或液相色谱法,在法庭痕量分析中经常用到。在对安全套残留物进行色谱分析之前,需要考虑一些关键因素：某些润滑剂具有较高相对分子质量（黏度大不适用于普通气相）、目标物质不具有挥发性（无法使用气相色谱法检测）或需要特定的检测参数。

4.1 气相色谱-质谱法

相色谱-质谱(GC-MS)法可用于分析PEG、壬苯醇醚-9[22]和亚硝胺[23]以及其它类型的烃基润滑剂(如凡士林)。但GC-MS 法不能直接分析PDMS,因为PDMS 的相对分子质量较大和难挥发,需要较高的温度来进行检测,通常超过了大多数常规仪器的最高温度限制,检测PDMS 需要对其进行衍生处理[25]。另外毛细管柱中含有PDMS,可能因为毛细管柱流失导致假阳性[1]。检测PEG 时,先进行色谱分离,然后进行电喷雾或化学电离(EI 或CI)MS 检测[24],仪器灵敏度随相对分子质量的增大而增加。电离源通常首选EI源,因为它可以利用数据库来验证分离的化合物。

气相色谱可以检测亚硝胺[23]、聚乙二醇[11]、壬苯醇醚-9[22]和PDMS[24]。PEG 和壬苯醇醚-9 的色谱图能够分别体现出这两种分子的不同低聚物[22],它们的检测限约为1 mg[11]。对于PDMS 分析,安全套的外表面是主要提取部位[13]。实验测试了包括固相微萃取(SPME)在内的各种取样方法,不同安全套的色谱图显示出一定相似性[13],其中硅氧烷的峰高较低,在色谱图中分离度很差；而其它化合物（例如羟基甲苯或十六酸和十八酸[13]）的峰则清晰可见,所以对PDMS 分析的结果是不确定的。GC 法还用于分析含有凡士林、油性化合物或甘油的润滑剂样品。对样品衍生化是很关键的步骤,该方法重复性好,检测限低,是可靠的实验方法。

在模拟案例研究中,发现目标化合物和生物流体之间不存在干扰。在阴道样本中发现了安全套表面遗留的润滑剂,作者得出结论,虽然从生物流体介质中提取的目标物中的亚硝胺比例低于安全套中亚硝胺总量的10%,但使用GC-MS 方法可以证明安全套被使用[13]。

4.2 裂解气相色谱-质谱

为了解决GC-MS 分析PDMS 中遇到的假阳性和仪器温度限制问题,可以将PDMS进行热解,将线性PDMS转化为低分子量物质进行分析。热解可以推断出聚硅氧烷分子的聚合度,并且可以检测出有机添加剂。

根据PDMS 的标准品热解图显示,主要为环状低聚物的组合物[12],如二甲基硅氧烷(DMS),这是PDMS 热解的特征产物,环状六聚体是其优选的构象[12]。结果表明,润滑剂粘度会影响热解图中峰面积的大小：粘度越低,峰面积越小[24]。热解温度也对结果有影响,热解产物的数量会随着温度的升高而减少[13]。必须施加相当高的温度(超过300°C)才能使PDMS 热解[13],但不能超过400°C,否则会破坏PDMS的裂解效果[26],标准检测限为0.1 ng。

在对安全套样品的检测中,裂解气相色谱-质谱(Py-GC-MS)检测到PDMS 成分,且没有观察到其它化学残留物[15],其检测限约为1 mg,结果表明,安全套品牌和型号之间没有显著差异。在一个未知样品中,Py-GC-MS 可以推断PDMS 粘度和其它有机化合物的存在[16]。Tottey 等人[27]成功地利用裂解方法研究了PDMS 在不同类型的生物区域（阴茎、阴道、皮肤、口腔等）中的持续性。

4.3 液相色谱

液相色谱(LC)通常用于GC无法分析的分子(如非挥发性化合物)。其中的紫外线检测可能不适用于所有类型的分子,需要仔细考虑实验条件[28]。

LC 可以分析亚硝胺[29]和杀精剂。分析杀精剂时,应考虑壬苯醇醚-9的两亲性来选择合适的色谱柱。使用正相色谱柱可能会在溶剂和ESI源之间产生不兼容的问题,实验通常使用反相色谱柱进行检测[30]。PDMS也可以在LC-MS中进行分析,使用大气压化学电离(APCI)源代替ESI 源进行质谱分析,这是检测未知聚硅氧烷的最合适最快的技术[31]。

检测壬苯醇醚-9时,LC分析显示分离分子中最多可能有17 种低聚物[20]。与UV-vis 二极管阵列检测器(DAD)相结合,LC能够检测mg/mL浓度的目标物,适用于残留的少量壬苯醇醚-9检测[32]。使用ESI源与质谱联用时,在质谱中观察到许多加合物,这是该方法的主要限制之一[30]。

通过LC 分析安全套和阴道避孕药样本,可以检测到壬苯醇醚-9。还发现安全套和其它避孕药之间的差异[30]。LC-DAD 方法可用于分析洗面奶、乳霜或避孕凝胶等混合物中的壬苯醇醚-9,以及各种载体上的残留物[33]。

Maynard等[6]在红外分析表明存在杀精剂时,使用LC 进行确认。在模拟案例研究中,LC 清楚地显示了样本拭子上的壬苯醇醚-9[30]。可以观察到拭子成分的一些干扰,当棉花作为拭子,则干扰可能性较小[32]。在含有阴道液模拟物或动物血浆的壬苯醇醚-9 混合物中,分析显示基质和分析物之间没有干扰[28]。综上,壬苯醇醚-9 是可以通过LC来检测的,但PDMS还没有用这种方法进行广泛的研究。

5 质谱分析

目前有许多质谱法用于分析安全套中的不同化合物。每种方法都有特定的质量范围、灵敏度及特异性。

5.1 电喷雾电离

电喷雾电离(ESI)技术通常与分离方法(例如液相色谱法)相结合使用,也可以单独使用。但样本必须满足两个条件：(1)样品必须是液体；(2)化合物的溶剂能够被电离。

ESI 和纳米ESI-MS 技术用于分析壬苯醇醚-9和PDMS。无论是单独使用[16]还是与凝胶渗透色谱耦合,ESI都具有良好分辨样品的能力。ESI光谱能够确定分子是环状还是线性形式,从而确认py-GC获得的结果[16]。但在检测质量超过4 000 Da的化合物时,离子抑制效应使这些化合物难以被检测[34]。

5.2 基质辅助激光解吸电离

基质辅助激光解吸电离(MALDI)是一种软电离技术,可分析聚合物、肽或其它高达30万Da的大分子。它可以用于安全套润滑剂(PDMS、PEG)的定性和定量。结合飞行时间(TOF)-MS,是目前这类分析的理想方法[16]。与傅里叶变换质谱联用可以分析壬苯醇醚-9。MALDI能够检测大摩尔质量的物质[34],但无法检测是否存在环状低聚物[16]。该方法比ESI更稳定,可重复性更强[34]。但该方法获得的光谱很复杂,因此很难检测到微量化合物。在检测实际安全套样本时,MALDI 可以检测到PDMS、PEG[35]和壬苯醇醚-9。虽然光谱结果中存在加合物,但对PEG 和壬苯醇醚-9 显示出良好的灵敏度[18,36]。MALDI并不总能检测到PDMS[36],必须考虑离子抑制、光谱质量及检测限的影响[35],壬苯醇醚-9的检测限为2.5 ng/mL,生物流体中的检测限约为0.003%～0.5%,具体数值取决于润滑剂的类别[35]。可以将结果与FTIR或拉曼光谱获得的结果进行耦合,以便获得更多信息并提高辨别能力。

5.3 其它类型的质谱分析

1994年,Blackledge等[2]将解吸化学电离(DCI)-MS方法作为验证方法来分析润滑剂(PDMS)。可以根据一系列特征峰检测PDMS是否存在。PDMS的黏度越低,结果的再现性越强。DCI 还可以区分不同来源和不同粘度的PDMS[7]。

解吸电喷雾电离(DESI)-MS 于2004 年开始使用[37],能够在环境温度下直接从载体上分析药物、有毒工业化合物、化学战药剂或爆炸物[38]。它可用于分析安全套润滑剂和杀精剂。也可能会检测到避孕套中的添加剂。该方法用于实际避孕套案例中,在避孕套上发现了7 种分子(PDMS、PEG、壬苯醇醚-9,以及其它不太常见的化合物如甲基吗啉、辛基胺、异氧132和二丁基甲酰胺)[39]。

实时直接分析(DART)-MS[40]的目的与DESIMS类似,它允许气体、液体和固体在正常实验室条件下(25℃,1个大气压)立即电离。该方法可用于分析壬苯醇醚-9和水基润滑剂。还可检测到其它化合物(利多卡因、苯并卡因、芳香剂等)。DART-MS 方法用于实际安全套润滑剂检测能够检测润滑剂和壬苯醇醚-9[41]。DART-TOF-MS 对样品制备要求较低[42]、具有良好的分辨率、能够准确的测定质量以及能够准确的将峰分配给特定分子。在实际样本中,DART-MS 可以检测到样本中是否存在壬苯醇醚-9[8]。但没有研究提到PDMS 的检测或可能与阴道基质的相互作用,Maric等[43]将其模型应用于实际案例。

6 总结与展望

在上述所有分析技术中,FTIR、py-GC-MS 和DART-MS 可以很好的分析PDMS 等非极性化合物,这些方法有着不同的分析角度,是可以互补的：FTIR 方便易得更适合于大多数实验室；DART-MS可以对样品进行良好的分类,具有较高的辨别能力；py-GC-MS 可以通过识别特定热解产物来确认PDMS的存在。相比之下,FTIR只能检测化学键和基团；FTIR 和DART-MS 需要较少的制备样品,可以在现场进行,比py-GC-MS 具有更好的可重复性。FTIR 和py-GC 都需要提取样品的步骤,DARTMS 则不需要。PDMS 的提取效率会因为溶剂的不同而变化,在实际案件中需要对样本重复提取,可能导致目标物损失或被稀释至低于检测限。关于极性组分(即PEG 和壬苯醇醚-9),LC-MS 等方法可作为FTIR的补充技术[4],LC-MS可以有效分析出这些极性组分,但LC-MS在分析实际样品和混合在人体基质中的化合物的运用还需进一步研究。从分析的角度来看,拉曼光谱也可以用于检测安全套使用痕迹,但需要确认所提供的信息是否与傅里叶变换红外光谱（FTIR）的结果互补或相同。表1总结了上面讨论的实验方法、目标化合物和不同的分析介质。根据表格所示几乎所有方法都适用于安全套痕迹检测。

表1 分析方法及其目标化合物和测试材料的总结

数学和统计工具（如化学计量学或贝叶斯网络衍生统计数据）也可用于评估不同安全套及其痕迹之间的区别,并对目标物的转移和持久性进行建模。在许多不同的研究中使用了主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）以建立一个模型,使其对含有不同成分的安全套进行分组[42‒43]。

安全套痕迹分析并不是新技术,目前对安全套痕迹的检测进行的研究主要基于安全套的化学特性提出了不同的检测方法。这些方法的目的基本都是识别安全套润滑剂及其它成分,并能够对不同的安全套品牌和类型进行分类。但很少有关于错误率和检测限的分析,也没有对安全套残留物或安全套成分进行量化分析以及在不同介质中的变异性和保留时间的相关实验。还需要开展更多侧重于化学特性的研究,明确已开发方法的潜力和适用范围,并对实验中可能出现的误解进行解释。