交叉引物扩增法快速检测牛病毒性腹泻病毒

2023-08-08贺泂杰

中国乳业 2023年7期

贺泂杰

中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州 730050

0 引言

牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea，BVD）是世界范围内最重要的牛畜疾病之一，不但损害动物福利，而且给牛肉产业和乳制品工业造成巨大的经济损失[1]。BVD是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起，是单链RNA病毒，大小约为12.3 kb，属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的代表种。这个属的成员中还包括羊边界病毒（BDV）和猪瘟病毒（CSFV）[2]。

根据临床表现将BVD分为急性和慢性两种。急性型病例常突然发病，症状为厌食，鼻、眼流出浆液性鼻漏，咳嗽，呼吸急促，流涎，精神委顿，体温达40 ℃，同时伴随白细胞减少。随着病情的发展，病牛鼻镜糜烂，表皮脱落，舌面上皮坏死，流涎增多，呼气恶臭，并且发生严重腹泻，犊牛死亡率高于高日龄的牛。部分病牛可出现蹄叶炎和趾间皮肤坏死糜烂，进而导致其跛行。成母牛病情严重程度不同，但其泌乳量会显著减少，甚至停止泌乳。慢性病例的病牛可出现明显的发热症状，但体温高于正常波动，病牛鼻镜糜烂连成一片，病牛眼角有浆液性分泌物，病牛口腔有少量糜烂，但齿龈通常发红。多数病例常出现跛行。大多数病例在患病2～6 个月后死亡，但也有部分病例病程在1 年以上。妊娠母牛感染BVDV常出现流产，或产下先天性免疫缺陷的犊牛，或是小脑发育不全。在妊娠后期感染BVDV，母牛还可产下免疫耐受的持续性感染的病牛，不表现临床症状，但免疫水平低下，并可持续向牛群中释放病毒，成为该病重要的传染源[3]。

PCR检测被认为是BVDV临床诊断的“金标准”[4]，多重PCR、实时PCR和巢式PCR由于其高灵敏度、特异性、时效性和可重复性，已广泛应用于BVDV检测[5]。但这些方法有一些固有缺点，如需要昂贵的设备和对扩增样品进行后续操作等，限制了它们的使用范围[6]。

交叉引物扩增（Cross-priming Amplification，CPA）是一种新型的等温扩增技术，可与核酸试纸条带结合用于BVDV感染的快速检测鉴定，是克服上述缺陷的一种替代工具[7]。CPA还允许扩增在没有任何仪器辅助的情况下实现肉眼可视化，是许多动植物病原体（细菌、病毒等）的有效诊断技术[8]。本文利用CPA检测方法，以5'UTR基因为靶点，特异性检测BVDV的mRNA，利用野外和试验感染的样本评估CPA检测的临床性能，并与传统PCR进行检测效率的比较。

1 材料与方法

1.1 粪便样本

2022年8月，对甘肃省某牧场100 份出现腹泻症状的犊牛进行抗生素治疗但无效，对犊牛腹泻粪便样本进行细菌检测，均呈现阴性。因此，又进行病毒检测，结果为BVDV感染。样本在-80 ℃下储存，待用。

1.2 主要试验材料和试剂

肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）、大肠埃希菌（Escherichia coli）和弯曲杆菌（Campylobacter）来自于中国广东环凯微生物科技有限公司；牛冠状病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）、牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV）由本实验室分离鉴定。

BstDNA聚合酶、10×TermopolReactionBufer、dNTPs和MgSO4，Takara公司；甜菜碱，美国Sigma公司；一次性核酸检测试纸，杭州优斯达公司；DNA提取试剂盒、凝胶提取试剂盒、质粒Mini试剂盒，美国OMEGA公司；GoldView染料，索莱宝科技有限公司。

1.3 引物设计

选择5'UTR基因作为靶基因设计CPA检测引物和探针。利用PRIMER5.0软件设计一组CPA引物，分析双相形成、发夹形成和引物二聚体。引物包括两个置换引物（5s和4a）、一个交叉引物2s1a和两个检测引物2s和3s。检测引物2s在5'端标记生物素，3s在5'端标记异硫氰酸荧光素（FITC）。该交叉引物由5'端2s和3'端1a组成。引物见表1。

表1 CPA引物和探针序列

1.4 BVDV-CPA反应体系建立

BVDV-CPA反应体系如表2。BVDV-CPA反应管60 ℃孵育60 min，80 ℃孵育2 min终止反应。检测CPA扩增时，将每种CPA产物5 μL与95 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合。

表2 BVDV-CPA反应体系

1.5 BVDV-CPA反应温度和反应时间的优化

将一次性核酸检测试纸放入稀释后的样品中，室温孵育2 min。同时显示检测线和控制线时，反应被认为是阳性，而仅显示控制线时，反应被认为是阴性。在56～66 ℃不同温度和20～120 min不同时间下检测，确定BVDV引物的最佳反应温度和反应时间。随后用一次性核酸检测试纸检测扩增产物。

1.6 BVDV-CPA灵敏性和特异性

为评价BVDV-CPA 检测方法的灵敏度和检出限度，本试验以RNase-free water为稀释液，将BVDV病毒RNA在0.025 6～2 000 pg/μL范围内稀释5 倍。8 种稀释度分别为2 000 pg/μL、400 pg/μL、80 pg/μL、16 pg/μL、3.2 pg/μL、0.64 pg/μL、0.128 pg/μL、0.025 6 pg/μL。

为评估特异性，采用CPA方法对BVDV RNA和其他引起牛腹泻的病原体[沙门氏菌肠炎（Salmonella Enteritidis）、大肠埃希菌（Escherichiacoli）、弯曲杆菌（Campylobacter）、牛冠状病毒、牛轮状病毒]进行特异性评估。所有结果均采用一次性核酸检测试纸，进行重复独立试验。

1.7 使用现场采集样本评估CPA检测准确率

采用PCR和基因测序再次确认所检测样本均为阳性样本。使用CPA和PCR检测现场采集的100 份阳性样本，将CPA结果与PCR结果比较，评估CPA检测的准确性。PCR反应体系如表3。PCR条件为：95 ℃一步初始变性3 min；35 个循环变性在95 ℃30 s，55 ℃30s，72 ℃延伸1min；最后一步在72 ℃下延伸5 min。PCR产物在含有GoldView染料的1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，并在紫外线下检测。

表3 PCR反应体系

2 结果

2.1 最佳扩增温度和时间

最佳CPA扩增温度在56～66 ℃的范围内确定。结果显示，在62 ℃和64 ℃时，CPA扩增效果良好。因此，选择62 ℃作为最佳扩增温度，用于后续的CPA反应（图1）。然后确定CPA扩增在62 ℃下后，时间20～120 min的范围内确定。结果显示，孵育20 min后出现一条弱线，60 min后观察到该线颜色最为显著（图2）。

图1 BVDV-CPA反应温度的优化

图2 BVDV-CPA反应时间优化

2.2 BVDV-CPA具有检测特异性

选择BVDV5'UTR基因作为目标序列设计CPA引物和探针。BVDV-CPA检测中使用引物和探针的特异性通过BVDV和其他引起犊牛腹泻的病原体：基因组进行评估，在62 ℃下扩增60 min后，只有BVDV的基因组呈阳性结果，这表明BVDV与其他病原体样本没有交叉反应（图3）。

图3 CPA-BVDV方法的特异性分析

2.3 BVDV-CPA的检测阈值

对RNA进行5 倍连续稀释，每次反应范围为2 ng～25.6 fg，重复进行评估。结果表明，CPA法灵敏度高，检出限为640 fg（图4）。

图4 BVDV-CPA检测限度

2.4 BVDV-CPA的阳性检出率

利用100 份现场阳性粪便样本，评估BVDV-CPA检测的性能。结果表明，BVDV-CPA阳性检出率88%，PCR阳性检出率为65%（表4）。因此，本研究建立的CPA方法比PCR检测法具有更高的准确性。

表4 BVDV-CPA与PCR的准确率对比

3 讨论

造成牛腹泻的因素很多，如饲料、畜舍条件等环境因素[9]以及细菌、寄生虫、病毒等引起的感染等[10]。后者常常造成该病的诊断难度较大，如不能准确确定致病因素，对症下药，会造成病情加重，甚至导致病牛死亡。因此诊断环节是防治BVD的关键[11]。本文建立一种检测BVDV感染的CPA方法。与PCR相比，该诊断技术不需要复杂设备，具有简单读出系统，易于操作，可用于诊断偏远或资源有限地区的BVDV检测。

在过去十年中，研究人员为简化病原体检测做出巨大努力。一些新技术和设备已被开发用于病原体检测。加快“样品-结果-输出”的疾病检测[12]，这可能为将来疾病诊断技术发展提供启示。其中CPA已被证明在检测人类、动物和植物病原体方面有效[13]，具高特异性和可视化优点，为核酸快速诊断提供便利，具有潜在的应用前景[14]。本研究设计引物，并建立一种CPA方法，针对BVDV 5'UTR基因，将CPA反应与逆转录结合，在恒温条件下扩增BVDV的RNA，在62 ℃下，用制备好的模板在60 min完成。产生的扩增子与核酸检测试纸结合时，使检测更容易。CPA检测BVDV的方法具很高特异性，并且在检测BVDV感染的临床样品中被证明有效，阳性检出率高。CPA检测在BVDV的现场监测中具有良好潜力。同时选择的BVDV 5'UTR基因保守序列是BVDV1型和2型中的共有序列，因此可以同时检测出BVDV1型和BVDV2型，但不能区分这两种类型病毒。

在开发成功的CPA检测方法过程中，引物设计至关重要。为准确检测，引物在确保特异性和敏感性方面起至关重要作用，其设计是CPA的难点之一。由于CPA检测使用5 个引物来识别目标DNA序列上5 个不同区域，这使CPA检测比用2 个引物的传统PCR更具特异性。同一管中存在多个引物可导致非特异性扩增，导致假阳性和误导性检测结果[15]。在确定最终BVDV 5'UTR CPA引物前，做了大量前期试验，筛选多套引物，以剔除给出非特异性扩增产物的引物。