气相色谱法检测R-3- 氨基丁醇的研究

刘丽荣，王晓茹，穆玉敏，张浩月，杨梦茜，刘 东，任丽梅

（1.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家庄 050000；2.石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035；3.河北省高校微生物制药应用技术研发中心，河北 石家庄 050035）

0 引 言

R-3- 氨基丁醇（R-3-amino-1-butanol） 是一种氨基醇类化合物，在有机合成和药物生产过程中用途广泛。在1977 年，报道R-3- 氨基丁醇是4-甲基环磷酰胺的关键中间体，而后者是抗肿瘤药物的抑制剂。

Tetrahed. Lett 报道R-3- 氨基丁醇可以衍生合成β- 内酰胺，进一步合成具有碳青霉烯类结构的抗生素；Drugs 报道在抗艾滋病药物度鲁特韦抑制剂的合成过程中，R-3- 氨基丁醇是其关键的中间体。近年来，世界艾滋病和肿瘤类疾病的增长蔓延已经引起各国政府和相关国际机构的关注和重视，相关防治措施和医疗方法需求的迫切性也使R-3- 氨基丁醇相关产品的合成研究和用途开发成为市场前景的课题之一。

作为一种手性氨基醇类，早期的氨基醇类物质主要以天然的氨基酸为原料还原得到。目前，合成R-3- 氨基丁醇的方法主要有硼氢化物还原法，以酒石酸为拆分剂的拆分法和以钌碳等为诱导剂的化学诱导法，以及近年来兴起的以各种酶为核心的生物催化、基因转移等合成方法。

目前，工业化生产的产品大多来源于化学合成，因资源环境和持续发展等系列问题，生物法的相关产品研究也在逐步走向市场。R-3- 氨基丁醇产品的产量和质量参差不齐，这对于合成最终产品的品质及生产成本有着很重要的影响，因此，建立一种准确而高效的氨基丁醇的检测方法显得尤为重要。

目前，氨基醇类的检测方法主要有薄层层析法、液相色谱法和气相色谱法等。早期的薄层色谱层析法，由于手工操作较多，人为因素导致定量和重现性较差。而R-3- 氨基丁醇本身没有紫外吸收，应用最广泛的液相紫外检测器检测时通常采用HPLC- 衍生法，衍生过程通常存在步骤繁琐、定性困难、定量准确性差等一系列问题。常用的气相色谱检测醇类物质成分时，一般使用挥发性溶剂，也存在定量误差。

本文针对气相色谱法中挥发性溶剂等特点，采用气相色谱内标法，选用用途广泛的氢火焰离子化检测器（FID），检测时样品用量少，定量检测时不需要衍生处理，方法的灵敏度、准确度和精密度普遍较高，操作简单方便。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

（1） R-3- 氨基丁醇对照品：95%，上海麦克林化学试剂有限公司。

（2） 含R-3- 氨基丁醇的供试样品：美和生物技术有限公司。

（3） 正丁醇：色谱纯，天津市大茂化学试剂厂。

（4） 甲醇：色谱纯，天津市康科德科技有限公司。

（5） 其他试剂均为分析纯，天津大茂化学试剂厂。

1.2 仪器设备

（1） 气相色谱仪：8860 型，配有氢火焰离子化检测器（FID)，美国Agilent 公司。

（2） 电子分析天平：FA1004A 型，上海精天电子仪器有限公司。

2 实验内容

2.1 色谱条件

（1） 色谱柱：KB-624 石英毛细管柱，60 m×0.32 mm×1.8 μm。

（2） FID 检测器温度：280 ℃。

（3） 进样口温度：250 ℃。

（4） 柱温条件：初温50 ℃，保持6 min，以10 ℃/min 的速度升温至220 ℃，并保持5 min。

（5） 柱流速（N2)：1.0 mL/min。

（6） 氢气流速：30 mL/min。

（7） 空气流速：400 mL/min。

（8） 进样量：1 μL。

（9） 分流比：20∶1，分流进样。

2.2 对照品溶液制备

准确称取4.341 6 g R-3- 氨基丁醇对照品，用无水甲醇溶解，并定容至25.0 mL，混匀，此对照品溶液中R-3- 氨基丁醇的浓度为165.0 mg/mL。

2.3 供试样品测定

2.3.1 供试样品配制

根据供试样品中含有R-3- 氨基丁醇组分的含量（检测浓度在线性范围内），准确称取适量样品试液，加入10 mL 容量瓶中，再加入0.5 mL 正丁醇内标，用甲醇稀释并定容，吸取稀释液，按照2.1 色谱条件，进气相色谱仪检测，进样量为1.0 μL。

2.3.2 结果计算

供试样品中R-3- 氨基丁醇含量X 的计算公式为：

式中：X 为供试样品中R-3- 氨基丁醇含量，mg/g；C 为对照品R-3- 氨基丁醇的质量浓度，mg/mL；V为供试样品的稀释定容体积，mL；A 为供试样品中R-3- 氨基丁醇的峰面积，mAu×s；As 为供试样品中内标正丁醇的峰面积，mAu×s；m 为供试样品质量，g；f 为供试样品的稀释倍数。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱的选择

R-3- 氨基丁醇在使用型号为DB-1、DB-5、KB-624 和DB-1701 等色谱柱检测时，均可出峰，综合考虑实验室资源共用情况，选用KB-624（60 m×0.32 mm×1.8 μm） 毛细柱，能将供试样品中R-3- 氨基丁醇和其他几种组分以及内标物完全分开，且峰形对称，各组分的分析时间分布合理。

3.2 分流比的选择

根据气相色谱分析原理特点，进样时适当的分流比可改善峰形。本实验依次选择分流比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1，分别进样后发现，随着分流比的增加，色谱峰宽度变窄，峰的分离效果越好，但相应检测器的响应信号降低，峰面积减小。

在分流比20∶1 时，各组分之间能完全分离，为提高响应值，因此，本实验检测条件选定分流比为20∶1。

3.3 溶剂的选择

供试样品测定过程中，由于对照品线性范围的限制及样品浓度的未知性，需要配制标准溶液或稀释样品。

由于测试样品中可能含有乙醇、乙酸乙酯及四氢呋喃等成分，故选用性质相似、沸点低且成本不高的甲醇来配制对照品溶液，稀释供试样品，出峰快，且不与产品中的其他溶剂杂质混淆，直观定性供试样品中溶剂残留情况。

对照品和溶剂的气相色谱图如图1 所示。

图1 对照品和溶剂的气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of reference substance and solvent

3.4 柱温的探讨

R-3- 氨基丁醇化合物的沸点相对较高，若柱温太低，汽化可能不完全，且峰型不好；若初始温太高，则供试样品中低沸点的成分易随甲醇溶剂一起流出，不易分离。

因此，选择初温为50 ℃，保持6 min，以每分钟10 ℃的速度升温至220 ℃，并保持5min。选择上述色谱柱温条件，能使供试样品中R-3- 氨基丁醇和其他各组分完全分离，色谱峰型良好，且分析时间控制在＜30 min。

3.5 定量方法选择

由于气相检测物质大多属于挥发性组分，且气相色谱仪FID 检测器属于质量型检测器，在定量检测时，各组分峰面积随着进样量的不同而变化，为改善因溶剂挥发，进样量重复性和仪器稳定性变化带来的误差，在供试样品检测过程中，分别选用外标法（ESTD)和内标法（ISTD） 进行比较。

ESTD 和ISTD 比较的结果见表1。

表1 ESTD 和ISTD 的比较Table 1 Comparison of ESTD and ISTD

由表1 可以看出，外标法测定供试样品得到的RSD 值分别为2.75%和2.17%，而内标法的RSD值分别为0.46%和0.94%，应用内标法计算结果的精密度明显略胜一筹。

在内标物的选择中，比较甲基叔丁基醚、异丙醇和正丁醇等几种化学试剂，其中，正丁醇的一些物理化学性质，色谱峰峰型与目标物R-3- 氨基丁醇相似，出峰位置靠近，是此检测实验中的合适内标物。

3.6 线性关系、检测限和定量限

依次吸取R-3- 氨基丁醇对照品溶液0.30、0.60、1.25、2.00、2.50、3.75 和6.00 mL，移入10 mL 容量瓶中，分别加入0.50 mL 正丁醇内标，用甲醇稀释并定容，混匀后分别进样。

以R-3- 氨基丁醇的质量与内标物质量比值为横坐标（X），对照品与内标物的峰面积比值作为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到回归方程为Y=0.102 6X-0.199 3，R2=0.999 2。

结果表明，该方法R-3- 氨基丁醇浓度在5.0 ～99.0 mg/mL 浓度范围内呈现良好的线性关系。分别以3.3 倍和10 倍标准偏差和与标准曲线斜率的比值的响应为方法的检测限（LOD） 和定量限（LOQ)，得 到LOD 为0.50 mg/mL，LOQ 为1.52 mg/mL。

3.7 专属性和系统适应性

分别精密吸取R-3- 氨基丁醇的空白溶剂、对照品溶液和供试样品溶液，按照2.1 色谱条件进行试验，测得R-3- 氨基丁醇保留时间为22.5 min，内标正丁醇保留时间为17.5 min，分离效果良好，空白样品在定性保留时间附近无杂质干扰峰，专属性和实验系统适应性良好。

空白、对照品和供试样品的气相色谱图如图2所示。

图2 空白、对照品和供试样品的气相色谱图Fig.2 Gas chromatograms of the blank，reference substance and sample

3.8 稳定性和重复性

准确称取同一批次供试样品6 份，按照2.3 的方法进行处理、检测，计算得到R-3- 氨基丁醇的平均值为936.9 mg/g，RSD 值为0.42%。实验结果表明，该方法的重复性良好。

取另一供试样品，在0、2、4、6、12、24 h进样测定，样品每次进样后4 ℃保存，进样前30 min 置于室温，检测结果见表2。

表2 稳定性的测定结果（n=6）Table 2 Determination result of stability （n=6）

由表2 可以看出，含R-3- 氨基丁醇的供试样品含量的RSD＜2.0%，表明该测试样品在4 ℃的条件存储下，24 h 内主成分含量变化不大，稳定性良好。

3.9 精密度和准确度

准确称取同一供试样品的前期、中期、后期以及残液各3 份，置于10 mL 容量瓶中，分别加入1、2 和5 mLR-3- 氨基丁醇对照品，按照2.3.1 制备不同浓度的供试样品溶液，每个浓度设置6 个平行，按照2.1 色谱条件和2.3 供试样品检测进行测定，结果见表3。

表3 回收率的测定结果（n=6）Table 3 Determination result of recovery rate（n=6）

由表3 可以看出，通过不同加标浓度测得样品的回收率为95.2%～99.7%，RSD 值为0.13%～0.97%，表明该方法的准确度和精密度良好，符合药典中回收率限度和精密度规定。

3.1 0 供试样品的检测

分别取实验生产中初期、中期、后期以及处理残液的供试样品，按2.3 方法制备并检测R-3- 氨基丁醇的含量，检测结果见表4。

表4 供试样品的测定结果Table 4 Determination results of the test samples

由表4 可以看出，供试样品中R-3- 氨基丁醇含量反应初期较少，随着时间推移，含量增加，而处理残液中的R-3- 氨基丁醇大部分已提取完成。整个测定结果及时准确监测了反应过程中和成品中R-3- 氨基丁醇的含量。

4 结 语

本文采用气相色谱内标法检测R-3- 氨基丁醇，供试样品取样方便，不需要衍生等复杂前处理，试样中目标物和几种溶剂分离完全。测试方法操作方便，分析结果的准确性和精密度符合药典相关标准规定。

本方法对由化学法或生物法等制备的样品均可检测分析，可应用于制备生产过程中含R-3- 氨基丁醇样品的跟踪分析和成品的测定。

该方法检测实施过程中还有一些待改进的地方，如由于受色谱柱等实验条件的限制，R-3- 氨基丁醇和其异构体的分离检测还需验证和优化；生产反应过程中，R-3- 氨基丁酸或羰基醇等底物的剩余量同时监测反应的转化率和转化过程等。

将通过更多试验，优化更新检测条件，能同时定性定量检测反应底物的浓度以及分离检测手性异构体等，让R-3- 氨基丁醇的过程监测和成品验收简单化、一步化。