以紫菜多糖为原料高产乙醇酵母的筛选与鉴定

◎ 苏 芳，段志成

（1.近海流域环境测控治理福建省高校重点实验室，福建 福清 350300；2. 福建技术师范学院， 福建 福清 350300）

目前，全球范围内存在能源紧缺问题，各国都在积极研究和开发新能源。生物燃料（生物乙醇和生物柴油）作为可再生的新型能源，是解决能源问题的一条重要途径。目前，几乎所有的生物乙醇是通过陆地粮食作物发酵产生，但世界上糖物质和谷物量是有限的，并且乙醇生产的原料成本相对昂贵。同时，将这些作物用于生产乙醇，势必会与人类食品需求发生竞争，其可能导致谷物和糖的价格上涨至较高水平，从而影响民生[1]。此外，种植这些作物需要大量的耕地，而耕地面积是有限的，这就导致其生产规模的不可持续[2]。全球海洋面积占地球表面积的71%，有丰富的海藻资源，每年单位面积内的生物质产量远高于陆地生物质[3]。不仅如此，海藻不仅可节约淡水资源、不占耕地、不需要喷洒农药和施加化肥，还可以转化温室气体CO2，是解决生物乙醇发展瓶颈的重要途径[4]。对于利用藻类多糖进行生物乙醇生产来说，酵母的发酵能力是关键。紫菜中含有大量的紫菜多糖，一般酵母难以降解利用。本文以紫菜多糖为底物进行高产乙醇菌株的筛选鉴定，并对其发酵性能进行研究，旨在为将来以紫菜为原料进行乙醇工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

土壤（福建技术师范学院五马山校区笃思公园内菜地）；酒曲（购自哈尔滨正中醇酒曲厂）；腐烂紫菜、腐烂猕猴桃、腐烂桑椹；紫菜多糖购自植提桥(西安)大健康产业咨询有限公司。

富集培养基：一水合葡萄糖50 g/L、半乳糖50 g/L、酵母浸膏2 g/L、细菌学蛋白胨10 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、七水合硫酸镁0.2 g/L，调节pH 为7.2（灭菌后加入无水乙醇10 g/L）。

筛选培养基：紫菜多糖粉30 g/L、酵母浸膏2 g/L、细菌学蛋白胨10 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、七水合硫酸镁0.2 g/L、琼脂粉15 g/L，调节 pH 至 7.2（灭菌后加入无水乙醇10 g/L）。

活化培养基：紫菜多糖粉30 g/L、酵母浸膏2 g/L、细菌学蛋白胨10 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、七水合硫酸镁0.2 g/L，调节 pH 至 7.2（灭菌后加入无水乙醇10 g/L）。

发酵培养基：紫菜多糖粉70 g/L、豆粕粉8 g/L。

PDA 培养基：PDA 培养基39 g/L。

麦芽汁培养基：麦芽汁培养基130 g/L。

产子囊孢子斜面培养基：麦芽汁培养基3 g/L、一水合葡萄糖10 g/L、酵母浸膏3 g/L、细菌学蛋白胨5 g/L、琼脂粉2 g/L。

氮源基础培养基：YNB 培养基68 g/L，使用前稀释 10 倍。

碳源基础培养基：一水合葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、氯化钠1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钙0.1 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 紫菜多糖发酵菌株筛选

取10 g 分离试样置于内含90 mL 富集培养基的250 mL 三角瓶中，在水浴恒温振荡器上120 rmp，37 ℃富集24 h。

取富集培养基培养后的培养基进行10 倍梯度稀释（ 10-2、10-3、10-4），随后将3 个稀释后的溶液涂布于筛选培养基上，置于37 ℃培养箱培养直至长出明显菌落。各样品按照各稀释梯度设置 3 组平行。

从上述平板中挑选出典型菌落进行四区划线分离、纯化。由于能利用紫菜多糖发酵高产乙醇的菌株会消耗筛选培养基平板中的紫菜多糖，菌株周围会产生透明圈，因此需要观察透明圈的大小，筛选出透明圈较大的菌落，重复上述四区划线纯化3 次。

1.2.2 紫菜多糖发酵菌的发酵实验

将筛选所得的菌株分别活化后接入装有100 mL 发酵培养基的三角瓶中，在120 rpm、37 ℃条件下，厌氧发酵96 h。将发酵液11 000 rpm 离心10 min 后移取上清液1 mL 至50 mL 容量瓶中定容将其稀释。随后，采用重铬酸钾-比色法测量乙醇含量，选出高产乙醇得率最高的菌株。

1.2.3 乙醇浓度的测定

乙醇浓度的测定采用重铬酸钾-比色法[4]。以 5%乙醇标准液作参比，在600 nm 的波长下，测定不同乙醇浓度的吸光度，绘制标准曲线，得出回归方程，再根据回归方程得到5 mL 稀释样品中的乙醇含量，再换算成发酵上清液中的乙醇含量。

1.2.4 糖度的测定

DNS（3,5-二硝基水杨酸）法[5]。

1.2.5 菌株常规鉴定

常规鉴定内容主要包括形态学特征、生理特征和生理生化特征。这些常规分类鉴定指标的鉴定方法，需根据国际微生物酵母分类中所描述的标准方法进行[6-8]。

1.2.6 生理生化特征

同化碳源试验：在氮源基础培养基中，分别加入适量半乳糖、赤藓糖醇、棉子糖、可溶性淀粉、蔗糖、木糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖、柠檬酸、核糖、肌醇、鼠李糖作为碳源，使其浓度为50 mmol/L，经0.22 μm 滤膜过滤后，分装到试管中。以仅含有氮源基础培养基的试管作为菌株不生长的空白对照，随后在各试管中接入1 环活化后实验菌株，在37 ℃条件下培养，在第1 周和第2 周观察。观察前，将菌液充分混匀，试管中出现浑浊计为“+”，澄清计为“-”。

发酵糖类试验：在氮源基础培养基中，分别加入适量葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖、核糖，使其浓度为50 mmol/L。0.22 μm 滤膜过滤后，分装到试管中，加入杜氏发酵罐后，各试管中接入1 环活化后实验菌株，在37 ℃条件下培养，每天观察有无气泡产生，有气泡计为“+”，无气泡计为“-”。

同化氮源试验：在碳源基础培养基中，分别加入硝酸钾、硫酸铵、赖氨酸、亚硝酸钠作为氮源，使其浓度达到50 mmol/L，经0.22 μm 滤膜过滤后，分装到试管中。以仅含有碳源基础培养基的试管作为菌株不生长的空白对照。随后在各试管中接入1 环活化后实验菌株，在37 ℃条件下培养，在第1 周和第2 周观察。观察前将菌液充分混匀，试管中出现浑浊计为“+”，澄清计为“-”。

1.2.7 菌株分子生物学鉴定

筛选分离菌株分子测序由都拜特生物有限公司完成。正反测序引物分别为鉴定酵母常用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。 测序结果查询NCBI 数据库，使用Blast 在线软件进行相似性分析。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

以紫菜多糖为唯一碳源进行筛选，通过比较透明圈大小，筛得紫菜多糖分解能力较强的3 个菌株。将这些菌株接种进行乙醇发酵并测定乙醇产量，筛选出1 株在紫菜多糖浓度70 g/L 的发酵培养基中乙醇产量达49.9 g/L 的高产菌株J1（酒曲来源）。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态特征观察

由图1 可以看出，J1 菌株的细胞显微形态呈卵圆形，无性生殖方式为芽殖且为一端芽殖（如图1A）；有假菌丝（如图1B）和子囊孢子形成（如图1C），且子囊孢子数量较少；菌落较小，质地呈奶酪状、粘稠、乳白色，有隆起，边缘较为整齐，容易被接种环挑起（如图1D）。

图1 菌株J1 的形态特征图

2.2.2 生理生化鉴定

菌株J1 在1 周内能同化半乳糖、棉子糖、可溶性淀粉、蔗糖、木糖、麦芽糖、纤维二糖、甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖、柠檬酸、核糖，不能同化赤藓糖醇、鼠李糖和肌醇，但到第2 周结束后可同化所有供试碳源（见表1）；能发酵蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖、核糖，但对棉子糖、半乳糖和核糖发酵能力相对较弱（见表2）；能同化硝酸钾、硫酸铵、赖氨酸、亚硝酸（见表3）。

表1 同化碳源试验结果表

表2 糖发酵试验结果表

表3 氮同化实验结果表

2.2.3 分子生物学鉴定

通过使用引物NL1 和NL4 对所筛菌株J1 进行26S rRNA 的基因序列进行扩增，得到大小为594 bp 的序列片段。经Blast 在线软件进行相似性分析并使用MEGA7 构建系统发育树后发现，菌株J1 以较高的置信度和酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y_1 聚于内群的同一分支上，同源相似度99.65%（如图2 所示）。说明J1 与酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y_1具有较近的亲缘关系，属于同一物种。因此，结合形态、生理生化特性及分子生物学测试结果，菌株J1 被鉴定为Saccharomyces cerevisiae J1。

图2 菌株J1 的系统发育树图

3 结论

本研究通过分离和筛选，得到一株能够分解紫菜多糖高产乙醇含量达49.9 g/L 的菌株J1。经生理生化鉴定和分子生物学鉴定，证实菌株J1 为 Saccharomyces cerevisiae J1。因此，本研究可以作为利用紫菜多糖提取乙醇酵母的依据。