TNF-α和FOXA2蛋白在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

黄梦盼，王学红，芦永福，

（1．青海大学研究生院，青海 西宁 810016；2．青海大学附属医院消化内科，青海 西宁 810012）

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是一种涉及遗传、环境和不良生活方式相互作用的多因素疾病。结直肠癌早期接受治疗的患者其5 年生存率可高达90%，晚期患者5 年生存率仅为12%，且预后仍然较差[1]。因此，筛查早期结直肠癌是降低其发病率和死亡率的关键策略之一。结直肠腺瘤-癌序列一直被认为是结直肠癌的主要发生途径，腺瘤从上皮增生发展而来，最初包含低级别异型增生，然后发展为高级别异型增生，随后发展为浸润性癌，这一过程可能需要10～15年[2]，从腺瘤到癌的长时间发展为CRC筛查提供了依据。慢性炎症通常是肿瘤发展所必需的[3]，炎症环境促进细胞增殖，削弱血管屏障，促进免疫细胞侵袭和迁移。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是一种同源三聚体蛋白，由活化的巨噬细胞及其他多种肿瘤细胞产生，巨噬细胞和肿瘤细胞分泌的TNF-α蛋白均可通过自分泌方式调节，从而加速肿瘤的进展。Obeed 等[4]发现TNF-α mRNA 在结直肠癌肿瘤组织中的相对表达水平显著高于邻近正常组织，此外，与早期CRC 患者相比，晚期CRC 患者组织中TNF-α mRNA 的表达显著升高。叉头框蛋白A2（forkhead box protein A2，FOXA2）是叉头框转录因子家族成员之一，包含两个转录激活域和一个叉头域，以DNA结合“翼状螺旋结构域”为特征。目前，关于TNF-α、FOXA2蛋白二者联合在结直肠癌变过程中表达及作用的研究较少。本研究将联合检测TNF-α、FOXA2蛋白在不同结直肠组织中的表达，分析这两个蛋白在结直肠癌的发生、发展及癌变中各自挥发的作用及相互关系，为结直肠癌的早期发现、临床诊断和治疗提供新思路及初步理论支持。

1 材料与方法

1.1 病例资料

收集2021年12月—2022年6月由青海大学附属医院首次确诊为结直肠癌，并在该院行手术治疗且病例资料完整的患者39 例，其中男性23 例，女性16 例，取CRC 组织及配对癌旁正常组织（距离肿瘤边缘5 cm以上，经病理证实为非肿瘤的组织）。病理类型均为结直肠腺癌，男性23 例，女性16 例，低分化腺癌16例，中-高分化腺癌23例；浸润深度未侵及浆膜层13例，浆膜层及以外26 例；无淋巴结转移19 例，有淋巴结转移20 例；临床分期I～II 期17 例，III～IV 期22例；临床分期标准参照国际抗癌联盟/美国癌症联合会制定的TNM 分期标准（第8 版）。选取同期结直肠腺瘤患者42 例，其中男性23 例，女性19 例；每位患者均采用肠镜切除结直肠腺瘤组织，经病理证实后用活检钳取2 块组织用于本研究。其中腺瘤直径＜1 cm 的28例，腺瘤直径≥1 cm 的14 例；管状腺瘤23 例，绒毛状腺瘤19例；无蒂腺瘤25例，有蒂腺瘤17例。

1.2 纳入与排除标准

本研究的病例纳入标准为：①所有研究对象均经病理学检查确诊为结直肠腺瘤或结直肠癌患者；②检测前均为原发性肿瘤，均未接受化疗、放疗及免疫等治疗；③患者愿意进入该项研究，并签署知情同意书。

排除标准为：①既往有其他系统肿瘤手术史者；②合并家族遗传性息肉病、炎症性肠病、血液系统疾病及自身免疫性疾病病史者；③严重感染，重要器官功能障碍，1 个月内服用激素类、免疫抑制剂、非甾体抗炎药者；④有结肠镜检查禁忌证者。

本研究已通过青海大学附属医院伦理委员会审批，审批编号SL-2019058。

1.3 试剂和仪器

一抗TNF-α 多克隆抗体购自Abbkine 公司，FOXA2抗体购自博士德公司，二抗HRP标记的山羊抗兔IgG购自Servicebio公司。

1.4 免疫组织化学染色

根据预实验结果，按1∶200 稀释配制TNF-α、FOXA2抗体。按说明书操作，所取组织标本均放入固定液中固定，经石蜡包埋后切片，脱蜡后经过梯度乙醇进行水化。将切片浸于修复液中加热进行抗原修复，等待液体温度冷却至室温后，放于PBS 缓冲液中浸泡，随后取出，用干净纱布擦拭去除多余液体，在切片组织上加入内源性过氧化物酶阻断剂。水洗后分别滴入一抗（TNF-α、FOXA2 抗体）孵育过夜，再滴加二抗，经DAB 显色，分化液分化后返蓝，脱水透明，待切片晾干后封片，显微镜下读片判读。

1.5 免疫组化染色结果判读

TNF-α、FOXA2蛋白免疫组化阳性产物呈棕黄色或棕褐色，主要位于细胞质、细胞核内。结果由2 名有经验的病理科医师双盲判读，采用半定量综合计分方法：高倍镜下随机选取4 个视野，根据染色阳性强度及阳性面积划分等级。阳性强度：基本无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。阳性面积：≤10%为0 分，＞10%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%为3 分。染色总分为强度评分与阳性面积评分之积，≤3分视为阴性，≥4分视为阳性。

1.6 统计分析

本实验选择SPSS 25.0 进行数据的统计和分析。计数资料统计描述采用率来表示，分析TNF-α和FOXA2蛋白表达与结直肠腺瘤、结直肠癌患者临床病理指标的关系采用卡方检验或校正卡方检验；TNF-α和FOXA2蛋白在结直肠癌中的表达水平相关性研究采用Spearman秩相关。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TNF-α蛋白在不同结直肠组织中的表达

TNF-α蛋白在结直肠3 种不同组织中的免疫组化染色观察结果见图1，阳性表达率统计分析见表1。TNF-α蛋白在癌旁正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤及CRC 组织中的阳性表达率分别为23.08%、50.00%和76.92%，癌旁正常结直肠黏膜组织中TNF-α蛋白表达最低，结直肠腺瘤和CRC组织与之相比，差异均有统计学意义（P＜0.05 或0.01），且结直肠癌组织中TNF-α蛋白阳性表达率显著高于结直肠腺瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 TNF-α蛋白在3种不同结直肠组织中阳性表达率的比较

图1 TNF-α蛋白在不同结直肠组织中的表达

2.2 TNF-α蛋白表达与患者临床病理指标的关系

2.2.1 TNF-α蛋白表达与结直肠腺瘤组临床病理指标的关系免疫组化分析结果见表2，不同腺瘤直径大小及组织学类型患者TNF-α蛋白表达阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、腺瘤数目、腺瘤形状患者TNF-α蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 TNF-α蛋白表达与结直肠腺瘤患者临床病理指标的关系

2.2.2 TNF-α蛋白表达与结直肠癌组临床病理指标的关系免疫组化分析结果见表3，TNF-α蛋白表达在不同分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期的结直肠癌组织间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；TNF-α表达在不同年龄、性别、肿瘤直径、部位及有无脉管神经侵犯的结直肠癌组织间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 TNF-α蛋白表达与结直肠癌患者临床病理指标的关系

2.3 FOXA2蛋白在不同结直肠组织中的表达

FOXA2 蛋白在结直肠3 种不同组织中的免疫组化染色观察结果见图2，阳性表达率统计分析见表4。FOXA2 蛋白在癌旁正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤及CRC 组织中的阳性表达率分别为23.08%、52.38%和79.49%；癌旁正常结直肠黏膜组织中FOXA2蛋白表达最低，结直肠腺瘤和CRC组织与之相比，差异均有统计学意义（P＜0.01）；且结直肠癌组织中FOXA2 蛋白阳性表达率显著高于结直肠腺瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 FOXA2蛋白在3种不同结直肠组织中的阳性表达率比较

图2 FOXA2蛋白在不同结直肠组织中的表达

2.4 FOXA2蛋白表达与患者临床病理指标的关系

2.4.1 FOXA2 蛋白表达与结直肠腺瘤组临床病理指标的关系免疫组化分析结果见表5，不同腺瘤直径大小及形状类型患者FOXA2 蛋白表达阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、腺瘤数目、组织学类型患者FOXA2蛋白阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4.2 FOXA2 蛋白表达与结直肠癌组临床病理指标的关系免疫组化分析结果见表6，FOXA2 蛋白表达不同分化程度、淋巴结转移和TNM分期的结直肠癌组织间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；FOXA2 蛋白表达在不同年龄、性别、肿瘤直径、部位、浸润深度及有无脉管神经侵犯的结直肠癌组织间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表6 FOXA2蛋白表达与结直肠癌患者临床病理指标的关系

2.5 结直肠癌组织中TNF-α和FOXA2表达相关性

Spearman秩相关分析表明，TNF-α和FOXA2在结直肠癌组织中的表达呈正相关（rs=0.475，P＜0.05），见表7。

表7 结直肠癌组织中TNF-α与FOXA2蛋白表达水平的相关性

3 讨 论

近年来，随着生活方式的改变、人口老龄化的加速和饮食结构的转变，中国CRC约占全球所有新增病例的30%[5]。虽然结直肠癌发病率呈上升趋势，但我们观察到结直肠癌死亡率略有下降[6]。这种减少可能至少涉及两个方面：首先，CRC筛查项目在早期阶段发现癌症已经在人群中证明了其有效性；二是结直肠癌患者的临床治疗和管理水平大幅提高。因此，通过预防性切除结直肠癌的癌前病变可使结直肠癌的发病率和死亡率显著降低。

TNF-α由19 种蛋白质组成，具有多种生物学功能，为细胞激活、分化、增殖、凋亡提供信号，还能调节多个组织和器官的免疫和炎症反应。本实验结果表明，TNF-α蛋白在结直肠腺瘤组及结直肠癌组的阳性率均显著高于癌旁正常结直肠黏膜组，且CRC组的阳性率高于结直肠腺瘤组。于秀冰等[7]检测120例CRC及癌旁组织中的TNF-α蛋白表达，结果发现CRC组织中TNF-α阳性表达率为71.67%，癌旁组织中TNF-α蛋白阳性表达率仅为26.67%，两者具有显著的统计学差异。本研究结果与其基本一致，随着病情的进展，TNF-α蛋白水平呈现进行性升高的趋势，提示其表达高低与结直肠癌变过程相互关联。本实验发现TNF-α蛋白阳性表达率与结直肠腺瘤病理组织分型相关，绒毛状腺瘤TNF-α蛋白阳性率显著高于管状腺瘤。研究表明[8]，绒毛结构成分占比越高，腺瘤恶性转化率越高，绒毛状腺瘤的癌变率较管状腺瘤明显升高[9]。TNF-α蛋白在直径＜1 cm 腺瘤中的阳性表达率显著低于直径≥1 cm的腺瘤，Lieberman等[10]发现，腺瘤的大小与发生浸润性癌的风险程度成正比，随着腺瘤大小的增加，≥1 cm 的腺瘤癌变率高达30.6%，而小腺瘤（6～9 mm）患者处于中等风险，癌变率为6.6%，提示随着腺瘤癌变风险增加，TNF-α蛋白在结直肠腺瘤中的表达增高。本研究结果发现，TNF-α蛋白表达阳性率较高，肿瘤的分化程度越差，浸润深度越深，淋巴结转移率越高，TNM分期越晚，这对判断CRC预后具有重要意义。本研究与龙华婧等[11]研究结果基本一致，其研究还表明TNF-α蛋白在CRC远处转移患者中的表达较未转移患者明显升高，TNF-α蛋白表达情况对判断是否发生远处转移具有重要意义。Stanilov等[12]发现TNF-α蛋白在CRC 患者血清中表达明显升高，并且TNF-α蛋白表达水平与肿瘤临床分期、分化程度呈正相关，生存分析提示血清TNF-α水平高的CRC患者的生存率明显低于TNF-α蛋白水平低的患者。TNF-α蛋白表达水平升高可能是一个独立的预后指标，可用于随访结直肠癌患者。

FOXA2蛋白促进肿瘤的发生、发展主要与TNF-α作用有关。Liu等[13]研究发现，IKK-α是TNF-α下游的重要激酶，在S107/S111 位点与FOXA2 相互作用并发生磷酸化，使其NUMB 蛋白表达下调，一系列过程使Notch 通路激活。Notch 信号通路在正常肠上皮的自我更新和稳态以及结直肠癌进展中至关重要，通路中的转录因子的过表达与CRC进展和转移相关。因此，通过TNF-α/IKK-α/FOXA2/NUMB/NOTCH1 通 路， 将TNF-α和FOXA2联系起来，为揭示肿瘤生长的分子基础和确定癌症治疗的潜在靶点提供了一个新起点。

叉头盒蛋白A2（FOXA2），是一种先锋转录因子，是维持各种细胞和组织正常功能的关键调节因子。多项研究通过激活不同通路证实FOXA2 蛋白与胃癌[14]、肺癌[15]、卵巢癌[16]、胰腺癌[17]等癌症的发生、发展有关。彭好[18]研究发现FOXA2 蛋白在正常结直肠黏膜组、增生性息肉组、腺瘤性息肉组、CRC组的阳性表达 率 为13.3%（6/45）、31.1%（14/45）、62.2%（84/135）、86.7%（39/45），且两两之间表达水平的差异有统计学意义，因此可以推断FOXA2蛋白对结直肠癌及癌前病变有一定的诊断价值。本研究结果与其基本一致，发现FOXA2蛋白在结直肠腺瘤及结直肠癌中高表达，而在癌旁正常结直肠黏膜组织中呈低表达，提示FOXA2蛋白在结直肠正常黏膜→结直肠腺瘤→结直肠癌的发生、发展过程中起了促进作用。本实验发现，FOXA2蛋白表达在腺瘤的大小和形状方面有统计学差异。与内镜下表现为扁平状或广基无蒂的病变相比，带蒂腺瘤发生率更高，但癌变的风险较低[19]，提示随着腺瘤癌变风险增加，FOXA2蛋白在结直肠腺瘤中的表达增高。本研究结果发现，FOXA2 蛋白阳性表达率越高，肿瘤的分化程度越差，淋巴结转移率越高，TNM分期越晚。本实验与既往多项研究报道相一致。Wang等[20]通过实时荧光定量PCR法检测FOXA2蛋白在结直肠癌组织中的表达水平，发现FOXA2 蛋白在CRC 组织中的表达明显高于正常结直肠组织，且高表达的FOXA2蛋白与CRC的分化程度、临床分期、淋巴结转移等显著相关。FOXA2蛋白在CRC癌变过程中发挥着重要作用，但其机制还不十分清楚，可能与FOXA2蛋白表达促进结直肠癌上皮-间质转化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）有关。EMT 是指细胞失去极性并破坏细胞间连接[21]，上皮细胞转变为可移动的间充质细胞，间质细胞的细胞间黏附能力降低，迁移能力增强，可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。E-钙黏蛋白（E-cadherin）的减少和波形蛋白（vimentin）的增加可以被认为是EMT 发生的标志[22]。作为一种癌基因，FOXA2蛋白可能增强结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Wang 等[20]通过体外和体内实验表明，下调FOXA2 蛋白的表达，可以抑制结直肠癌细胞系HCT116和HT29细胞G1期向S期的转变，降低体外结肠癌细胞的增殖。同时，肿瘤组织中E-cadherin 表达上调，vimentin 表达下调，提示EMT 被抑制。EMT 可能是FOXA2蛋白促进结肠癌转移的关键因素。

本研究分析TNF-α和FOXA2 蛋白两者在CRC 组织之间表达的相关性，结果显示：在结直肠癌组织中TNF-α与FOXA2蛋白的表达呈正相关，说明二者在结直肠癌发生、发展过程中的作用是相互协同的。当结直肠腺瘤患者组织中TNF-α、FOXA2蛋白表达为强阳性时，癌变的可能性大，应引起足够的重视，需要定期复查、密切监控。目前对于TNF-α和FOXA2蛋白参与腺瘤发生及癌变的机制还尚不明确，本研究选取样本量相对较少、入组患者的来源地域较单一局限，仍然需要多中心、多地区、多人群的研究及更多的实验进一步深入探索结直肠癌变过程的发生机制。