基于脑小血管病临床脑血流特点构建并评估不完全性全脑缺血再灌注大鼠模型*

王珊珊， 徐昊， 侯培媚， 李泽康， 周丽娟， 葛金文△

· 实验技术 ·

基于脑小血管病临床脑血流特点构建并评估不完全性全脑缺血再灌注大鼠模型*

王珊珊1，2， 徐昊1，2， 侯培媚2，3， 李泽康2，4， 周丽娟1，2， 葛金文1，2△

（1湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2湖南中医药大学中西医结合防治心脑血管疾病湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；3湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南 长沙 410208；4湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

基于脑小血管病（CSVD）的脑血流特点构建和评估不完全性全脑缺血再灌注大鼠模型，以期为CSVD等缺血性脑血管疾病的基础研究提供理想的大鼠实验模型。将126只雄性SD大鼠随机分为假手术（sham）组、轻损伤模型组（minor组）和重损伤模型组（serious组），每组42只。采用双侧颈总动脉夹闭-开放循环操作的方法，构建大鼠不完全性全脑缺血再灌注模型，激光散斑血流成像系统评估脑血流实时变化；于造模后2、24和72 h，评估造模动物存活率和动物行为学（平衡木实验，BBT）评分；于造模2、24和72 h取材，采用HE染色观察大鼠不同脑区组织病理形态改变；并运用非靶向代谢组学分析模型大鼠血浆和脑皮质区差异代谢物，评估模型损伤程度。（1）与sham组比较，minor组和serious组大鼠总存活率平均值分别为83.2%和73.7%（<0.05）；（2）残存脑血流量平均值分别为56.3%和40.9%；（3）神经功能检查显示，与sham组比较，minor组和serious组造模后2、24和72 h的BBT评分均显著升高（<0.05）；（4）HE染色镜下可见广泛脑皮质（M1区和RSA区最为明显）、腹内测下丘脑腹外侧部（VMHvl）和海马C2区神经细胞形态发生不同程度改变。（5）非靶向代谢组学结果显示，sham组和serious组大鼠血浆差异性代谢物总数45个，上调代谢物总数33个，下调代谢物总数12个；脑皮质RSA区差异性代谢物总数19个，上调代谢物总数6个，下调代谢物总数13个，提示造模导致了大鼠神经-内分泌功能的紊乱。双侧颈总动脉夹闭-开放循环造模方法可导致大鼠脑皮质、VMHvl和海马C2区散在性广泛损伤，其损伤机制可能与代谢紊乱、氧化应激损伤等有关。该模型为研究CSVD反复缺血再灌注损伤提供了新的大鼠实验模型。

脑小血管病；缺血性脑卒中；缺血再灌注损伤；动物模型

脑小血管病（cerebral small vessel disease， CSVD）是由各致病因素导致脑内微循环发生病理改变的一种临床综合征，可进展为缺血性脑卒中（ischemic stroke， IS）［1］。其发病隐匿，临床诊断主要依靠影像学检查，无特异性药物，病人往往进展至IS才进行溶栓或抗凝干预，但其伴发的严重并发症使临床获益受限，因此，提前防治CSVD，延缓病程发展意义重大。大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）模型是研究IS等缺血性脑血管疾病的经典动物模型，是通过从颈内静脉插入线栓至大脑基底动脉环实现阻断血流供应的目的（数小时后拔出栓线模拟缺血再灌注损伤），该方式造模后TTC染色可见脑缺血灶，可还原病人IS发生后脑组织的病理损伤，对IS的防治研究具有重要意义。然而，IS的发病是复杂的病理生理学过程，CSVD由于内皮损伤和微血栓形成使得病人多经过漫长而反复的短暂脑缺血过程［2］，这种全脑反复缺血再灌注损伤是MCAO模型不能模拟的。

CSVD目前有4种主流的动物模型：低灌注损伤模型、高血压相关性模型、基因修饰相关模型和微小栓子栓塞模型［3］。虽然造模后动物可出现神经行为学改变和学习记忆力受损，脑组织形态损伤集中于大脑皮质及海马区［4］，但这些造模方式主要模拟的是实验动物脑组织血流持续性灌注不足，未考虑再灌注引起的二次损伤，因此更适用于研究低灌注引起的血管性痴呆。加之，大多数造模方式损伤程度不一，对操作者手术技能要求高，动物死亡率较高，不利于中医药防治研究，且与CSVD一过性血流中断后再灌注不完全相符。本项目在传统的双侧颈动脉结扎（bilateral carotid artery ligation， BCAL）模型的实验基础上设计了一种不完全性全脑缺血再灌注模型，旨在模拟CSVD发病前的反复一过性缺血再灌注损伤，试图阐明该模型下大鼠脑组织形态学和代谢组学变化，为CSVD基础研究提供大鼠实验模型。

材料和方法

1　动物

4～6周龄SPF级雄性SD大鼠，体重（220±20） g，购自湖南斯莱克景达有限公司，合格证号：SCXK（湘）2019-0004。本实验获湖南中医药大学实验动物中心伦理委员会批准，伦理审批号为：LL2019092009。

2　主要试剂

4%多聚甲醛（货号：G1101-500ML）和HE染色试剂盒（货号：GP1031）购自Servicebio；TissueFAXS PLUS型全景组织扫描成像系统（TissueGnostics GmbH）；多普勒激光散斑血流仪（Moor FLPI-2）。

3　主要方法

3.1动物实验分组126只SPF级SD大鼠，随机分为3组：假手术（sham）组、轻损伤模型（minor）组和重损伤模型（serious）组，每组42只。

3.2动物模型制备4周龄雄性SD大鼠于（26±2） ℃适应性喂养12 h，使用25%乌拉坦和10%水合氯醛1∶1复配，腹腔注射麻醉，剂量为4.5 mL/kg。在低灌注损伤模型的基础上建立不完全性全脑缺血再灌注模型［4-5］。sham组：分离双侧颈总动脉后缝合伤口；minor组：分离双侧颈总动脉，在激光散斑血流成像系统下，连续操作5次动脉夹夹闭1 min后放开1 min，缝合皮肤；serious组：分离双侧颈总动脉，在激光散斑血流成像系统下，连续操作10次动脉夹夹闭1.5 min后放开1 min，缝合皮肤。各组分别于造模后2、24和72 h处死取材。激光散斑血流成像系统记录实时血流量，残存脑血流量（%）=造模后脑血量/初始脑血量×100%。

3.3存活率计算存活率（%）=对应时点剩余动物数/（组内动物总数-上一时点死亡动物数）×100%。

3.4平衡木实验（beam balance test， BBT）评分测试时，将大鼠放于宽1.5 cm木条上，一端悬空，一端固定于40×40 cm平板中心，记录大鼠2 min测试时间内平衡能力。评分标准：在木条上站稳，无摇晃，持续2 min记1分；在木条上站稳，左右摇晃，未滑下，持续2 min记2分；在木条上站立，下滑至一侧，未掉下，持续2 min记3分；在木条上站立不到2 min即从木条上掉下记4分；试图在木条上站稳、但在数秒钟即掉下记5分；无任何站立能力记6分。

3.5脑组织病理学观察2、24和72 h进行BBT评分后，采用相同方法麻醉，仰卧位固定，沿腹正中切口暴露腹主动脉，采血收集入肝素管直至大鼠死亡；剪开下腔静脉，沿心脏左心室进针，4%多聚甲醛灌注直至肝脏呈粉红色，断颈，冰上取全脑，入4%多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片、脱蜡后HE染色。

3.6血浆和脑皮质非靶向代谢组学检测sham组和serious组于术后72 h采用相同方法麻醉、取血后，剪开下腔静脉，沿心脏左心室进针，预冷生理盐水灌注直至肝脏呈粉红色，断颈，冰上取全脑，分离额、颞叶部脑皮质入液氮急冻后-80 ℃保存。代谢组学检测上机前，取sham组和serious组存于液氮中、经研磨后的脑皮质组织样品各100 mg（或取血浆样品各100 μL），置于EP管中，加入500 μL的80%甲醇水溶液；涡旋震荡，冰浴静置5 min，15 000×、4 ℃离心20 min；取一定量的上清液，加质谱级水稀释至甲醇含量为53%；15 000×、4 ℃离心20 min，收集上清液，进样LC-MS分析。上机条件如下：Hyperil Gold C18色谱柱，正离子模式下，流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）；负离子模式下，流动相为pH 9的5 mmol/L醋酸铵（A）-甲醇（B）；梯度洗脱：0～1.5 min，98% A；1.5～3 min，98%～0 A；3～10 min，0 A；10～10.1 min，0～98% A；1.01～12 min，98% A；柱温40 ℃；体积流量0.2 mL/min。

4　统计学处理

4.1常规实验数据分析使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。结果以均数±标准差（mean±SD）表示。数据两组间比较，满足正态性者采用检验；多组间比较，满足正态性和方差齐性者采用单因素方差分析，方差不齐者采用秩和检验。以<0.05为差异有统计学意义。

4.2非靶向代谢组学分析上机数据导出为raw格式，使用诺禾致源Novomagic云平台进行数据分析。使用KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）、HMDB数据库（https：//hmdb.ca/metabolites）和LIPIDMaps数据库（http：//www.lipidmaps.org/）对鉴定到的代谢物进行注释。

结果

1　各组大鼠的存活率

sham组大鼠术后2、24和72 h的存活率平均值分别为96.3%、100%和100%，总存活率平均为97.2%；minor组大鼠造模后2、24和72 h的存活率平均值分别为89.1%、96.7%和96.7%，总存活率平均为83.2%；serious组大鼠造模后2、24和72 h的存活率平均值分别为86.3%、94.2%和90.6%，总存活率平均为73.7%。与sham组比较，minor组和serious组2 h和总死亡率显著增升高（<0.05）。见表1。

表1　不同时点各组大鼠存活率的变化

*<0.05sham group.

2　各组大鼠行为学变化

术中大鼠可见呼吸加深加快；术后24 h即可见大鼠左右眼大小改变，左右肢肌张力减退，部分重损伤动物可见走路不稳，身体倾斜，转圈，见图1。

Figure 1.　Typical muscle （orbicularis oculi） weakness changes of the rats in each group 72 h after surgery （n=42）.

sham组大鼠操作后2、24和72 h的BBT评分平均值分别为1.67、1.25和1.33；minor组大鼠造模后2、24和72 h的BBT评分平均值分别为3.63、2.80和2.63；serious组大鼠造模后2、24和72 h的BBT评分平均值分别为3.67、2.83和2.70。与sham组比较，minor组和serious组2、24和72 h的BBT得分均显著升高（<0.05）。见表2。

表2　不同时点各组大鼠BBT评分

*<0.05sham group.

3　各组大鼠脑血流量变化

minor组造模后脑实时血流平均降低至基线的（56.3±4.5）%，serious组造模后脑实时血流平均降低至基线的（40.9±9.2）%，见图2。

Figure 2.　Cerebral blood flow monitoring in the rats of each group before and after modeling using a laser speckle blood flow imaging system （n=15）.

4　各组大鼠脑组织HE染色

HE染色结果显示，sham组大鼠脑组织结构正常，未见病理改变；minor组和serious组大鼠初级运动皮质（primary motor cortex， M1）、压后无颗粒皮质（retrosplenial agranular cortex， RSA）和腹内侧下丘脑腹外侧部（ventrolateral part of ventromedial hypothalamus， VMHvl）均可见不同程度的细胞深染和胞质融合，细胞核消失，部分细胞核固缩，胞质成空泡状，细胞形态改变，边界不清，纹理紊乱，相同脑区细胞密度改变，但不同脑区的损伤程度和进程不统一；serious组在海马C2区也可见细胞深染、胞质融合和纹理紊乱，提示脑组织病理改变，见图3。

Figure 3.　Pathological changes in different encephalic regions of the rats in each group at each time point （HE staining， scale bar=20 μm）. M1： primary motor cortex； RSA： retrosplenial agranular cortex； VMHvl： ventrolateral part of ventromedial hypothalamus； C2： hippocampal C2 region.

5　各组大鼠血浆和脑皮质代谢物变化

sham组和serious组大鼠血浆共鉴定692个共有代谢物，其中差异性代谢物总数45个，上调代谢物总数33个，下调代谢物总数12个，见图4及表3、4。

Figure 4.　Volcanic map of plasma differential metabolites in the rats of each group. Red： up-regulated metabolites in serious group vs sham group； green： down-regulated metabolites in serious group vs sham group； grey： no difference （ND）. n=3. Variable importance in projection （VIP）>1.0， fold change （FC）>1.2 or FC<0.833， and P<0.05.

Figure 5.　Volcanic map of cerebral cortex differential metabolites in the rats of each group. Red： up-regulated metabolites in serious group vs sham group； green： down-regulated metabolites in serious group vs sham group； grey： no difference （ND）. n=3. Variable importance in projection （VIP）>1.0， fold change （FC）>1.2 or FC<0.833， and P<0.05.

表3　各组大鼠血浆差异代谢物（第1～29号）

表4　各组大鼠血浆差异代谢物（第30～45号）

sham组和serious组大鼠脑皮质共鉴定440个共有代谢物，其中差异性代谢物总数19个，上调代谢物总数6个，下调代谢物总数13个，见图5及表5。

表5　各组大鼠脑皮质差异代谢物

讨论

IS严重影响人类健康，预防的现实意义远大于治疗。近年来针对IS的发病机制研究逐年显著增加，其中动脉粥样硬化导致的CSVD是一种主要的IS发病前状态。由于临床起病隐匿，患者无或仅有轻微临床表现，导致其诊断和防治受限，而无代表性的动物模型又使得其临床前基础研究受限。CSVD关键病因是动脉粥样硬化，动脉粥样硬化可导致血管内皮损伤增生狭窄，微血管自身调节减弱，各种致病因素引起血管短暂收缩或痉挛使脑微循环血流供应不足可频繁发生一过性脑缺血，而随着致病因素的解除或减弱，微循环又可恢复血流供应而出现再灌注损伤。而且患者颅脑CT未见明显梗死灶，常出现一过性头晕、疲乏等症状。本项目组构建和评估了这种不完全性全脑缺血再灌注模型，拟为CSVD等缺血性脑血管疾病防治提供基础研究大鼠模型。

目前CSVD基础实验常用的MCAO和BCAL模型仅反映了缺血环节损伤，不能体现再灌注二次损伤，又受创伤性大、死亡率较高、术后恢复较差的影响［5］，提高了对实验者操作手法要求和研究成本。本实验设计的大鼠模型死亡多发生在2 h内（含sham），除造模损伤外还考虑麻药不耐受或联合作用引起，但整体死亡率不超过27%，显著优于MCAO和BCAL模型。脑血流量、动物行为学和组织病理形态是脑损伤动物模型评价的重要指标。多普勒激光散斑结果显示，造模后大鼠即时脑血流量显著降低，提示模型成功。造模后动物出现乏力、进食量减少、步态不稳、部分大鼠出现肌无力（主要表现为眼轮匝肌和下肢屈肌肌群）。BBT结果显示，造模后2、24和72 h，minor组和serious组评分较sham组均显著升高，但2 h sham组评分也高于其24 h和72 h，考虑2 h这一时点麻药的持续性效果可能影响了神经功能评估。而24和72 h的结果显示，随着恢复期时间延长，神经功能评分逐渐降低，提示该模型损伤程度较轻，对行为学改变有一定自愈性，适用于短期或预防性用药的药效学评估。有研究显示，双侧颈总动脉结扎主要引起大鼠额叶皮质和海马区局部血流明显下降，随着缺血时间延长，神经元出现水肿、凝固性坏死和微空泡形成［6］。本研究的HE染色结果显示，造模后可见广泛脑神经元损伤，受损的脑区涉及到自主运动、嗅觉感知、空间记忆、学习社交、短期记忆等，可能与大鼠表现单侧眼睑下垂、肌张力降低、食欲减退有关。脑皮质区损伤程度上与造模次数无关，但与造模时间相关。损伤最明显的是脑皮质M1和RSA，造模24 h即可见细胞水肿、排列紊乱，72 h则见大量神经元核固缩、轴突消失、小胶质细胞增生和微空泡形成，提示在无干预情况下神经元损伤不可逆。而VHMvl和海马C2区损伤程度与造模次数密切相关，其病理改变仅在serious组造模24 h后可见细胞间隙增宽、神经元丢失、核固缩等。以上结果提示不同造模方式引起的脑损伤区略为不同，而在无干预条件下，受损神经元72 h内不可恢复。

代谢组学可反映已发生的病理损伤情况，本实验对serious组和sham组血浆和RSA脑区的代谢组学进行了分析，结果提示该模型可导致脑内神经细胞能量代谢障碍、氧化应激损伤、兴奋性毒性及血小板功能障碍等。其中，柠檬酸和异柠檬酸含量增加提示三羧酸循环、二醛酸和二羧酸代谢异常，能量供应和线粒体功能障碍；还原性谷胱甘肽通过谷胱甘肽过氧化物酶催化过氧化氢和脂质过氧化物的还原并形成氧化型谷胱甘肽以防御氧化应激［7］，其降低提示细胞对抗氧化应激损伤能力减弱；5-磷酸吡哆按减少提示维生素B6代谢障碍，抑制能量物质的生物合成代谢；前列腺素E1降低，前列腺素F2α升高，提示内皮功能障碍，微循环血管舒缩不良；苯基丙酮酸增加，苯丙氨酸减少提示丙氨酸羟化酶缺乏，多巴生成障碍。RSA脑区代谢组学结果整体。

进一步鉴定分析血浆代谢物差异，结果显示，与sham组比较，serious组血浆中有33个代谢物上调，12个代谢物下调。其模型动物代谢异常与CSVD、IS患者或tMCAO模型动物代谢紊乱相似［8-11］。其中，α-酮戊二酸、柠檬酸、苹果酸和异柠檬酸升高提示脑内能量代谢障碍导致了代谢物在血液中进一步堆积，氢醌增加提示氧化应激损伤；花生四烯酸是一种ω-6多不饱和脂肪酸，与膜蛋白相互维持细胞膜的流动性，通过环氧合酶途径可介导下游底物前列腺素增加，其消耗、脑内前列腺素E1降低和前列腺素F2α升高均提示脑微循环内皮细胞受损，促凝和炎性物质增加。血浆代谢组学结果提示造模导致的脑损伤已影响到全身能量供应、氨基酸代谢、氧化应激和磷脂代谢等功能；尽管血浆中有部分代谢物对细胞自我修复有益（富马酸和硫辛酸），提示模型动物在造模后可能有一系列调节机制以代偿缺血缺氧及再灌注所引起的细胞损伤，但代谢物间功效抵消和代谢物自身堆积可能只会引起更进一步的细胞受损［12］。

综上所述，这种通过反复夹闭-开放颈总动脉造模的不完全性全脑缺血再灌注模型主要模拟CSVD反复缺血再灌注的脑血流特点，不同造模次数对脑区损伤的程度和时程不一，可根据研究脑区的不同设置造模条件。本研究为CSVD防治的基础研究提供了大鼠实验模型。

［1］中国研究型医院学会脑小血管病专业委员会《中国脑小血管病诊治专家共识2021》编写组. 中国脑小血管病诊治专家共识2021［J］. 中国卒中杂志， 2021， 16（7）：716-726.

Chinese Research Hospital Association. Committee of Cerebral Small-Vessel Disease. The writing group of Consensus of Chinese Experts on the Diagnosis and Treatment of Cerebral Small-Vessel Disease 2021. Consensus of Chinese Experts on the Diagnosis and Treatment of Cerebral Small-Vessel Disease 2021［J］. Chin J Stroke， 2021， 16（7）：716-726.

［2］侯外方， 张茂森， 张琳， 等. 血管性认知障碍动物模型的研究进展［J］. 中国实验动物学报， 2021， 29（4）：542-552.

Hou WF， Zhang MS， Zhang L， et al. Research progress on animal models of vascular cognitive impairment［J］. Acta Lab Anim， 2021， 29（4）：542-552.

［3］王香元， 佘瑞宁， 方锐， 等. 脑小血管病实验动物模型及制备方法研究进展［J］. 中草药， 2022， 53（18）：5851-5860.

Wang XY， She RN， Fang R， et al. Research progress on experimental animal models and preparation methods of cerebral small vessel disease［J］. Chin Herb Drugs， 2022， 53（18）：5851-5860.

［4］谭洁， 韩国栋， 张泓， 等. 改良大鼠双侧颈总动脉结扎方式建立血管性痴呆模型的评价研究［J］. 中国康复医学杂志， 2017， 32（3）：264-268.

Tan J， Han GD， Zhang H， et al. Evaluation of a modified bilateral carotid artery ligation method for establishing a vascular dementia model in rats［J］. Chin J Rehabil Med， 2017， 32（3）：264-268.

［5］孙莉， 吴江， 王守春， 等. 血管性痴呆大鼠脑血流量及细胞凋亡的研究［J］. 中华老年心脑血管病杂志， 2001， 3（6）：409-411.

Sun L， Wu J， Wang SC， et al. Study on cerebral blood flow and cell apoptosis in vascular dementia rats［J］. Chin J Geriatr Heart Brain Vessel Dis， 2001， 3（6）：409-411.

［6］吴章福， 高晓平， 李光武. 改良双侧颈总动脉结扎法与传统法制备的大鼠慢性脑缺血模型比较［J］. 中国康复医学杂志， 2012， 27（3）：206-210.

Wu ZF， Gao XP， Li GW. Comparison of modified bilateral common carotid artery ligation method with traditional method in rat chronic cerebral ischemia model［J］. Chin J Rehabil Med， 2012， 27（3）：206-210.

［7］ Adeoye O， Olawumi J， Opeyemi A， et al. Review on the role of glutathione on oxidative stress and infertility［J］. JBRA Assist Reprod， 2018， 22（1）：61-66.

［8］孟敏， 李林. 双侧颈总动脉结扎致血管性痴呆大鼠模型研究进展［J］. 中国康复理论与实践， 2018， 24（3）：309-312.

Meng M， Li L. Research progress on a rat model of vascular dementia induced by bilateral carotid artery ligation［J］. Chin J Rehabil Theory Pract， 2018， 24（3）：309-312.

［9］张天舒， 阮志， 刘霞， 等. MCAO大鼠脑缺血再灌注损伤机制的核磁共振代谢组学研究［J］. 中国药科大学学报， 2016， 47（2）：188-198.

Zhang TS， Ruan Z， Liu X， et al. Nuclear magnetic resonance metabolomics study on the mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury in MCAO rats［J］. J Chin Pharm Univ， 2016， 47（2）：188-198.

［10］ Liang J， Han R， Zhou B. Metabolic reprogramming： strategy for ischemic stroke treatment by ischemic preconditioning［J］. Biology， 2021， 10（5）：424.

［11］刘玉敏， 魏珍玉， 陈昕， 等. 基于GC-TOFMS技术的缺血性脑卒中代谢组学研究［J］. 上海交通大学学报（医学版）， 2017， 37（2）：207-211.

Liu YM， Wei ZY， Chen X， et al. Metabolomics study of ischemic stroke based on GC-TOFMS technology［J］. J Shanghai Jiaotong Univ （Med Sci）， 2017， 37（2）：207-211.

［12］ Harshfield EL， Sands CJ， Tuladhar AM， et al. Metabolomic profiling in small vessel disease identifies multiple associations with disease severity［J］. Brain， 2022， 145（7）：2461-2471.

Construction and evaluation of an incomplete global cerebral ischemia-reperfusion rat model based on hemodynamic characteristics of cerebral small vessel disease

WANG Shanshan1，2， XU Hao1，2， HOU Peimei2，3， LI Zekang2，4， ZHOU Lijuan1，2， GE Jinwen1，2△

（1，，410208，；2，，410208，；3，，，410208，；4，，410208，）

To construct and evaluate an incomplete global cerebral ischemia-reperfusion rat model based on the hemodynamic characteristics of cerebral small vessel disease （CSVD）， so as to provide an ideal rat model for investigating ischemic cerebrovascular diseases such as CSVD.A total of 126 male SD rats were divided into sham， minor， and serious groups （=42）. The bilateral common carotid artery clamp-open circulation operation was used to construct the incomplete global cerebral ischemia-reperfusion rat model， and real-time changes of cerebral hemodynamics were assessed by a laser speckle blood flow imaging system. At 2， 24 and 72 h after the model was constructed， the survival rate and animal behavior （beam balance test， BBT） score were evaluated， and the materials of the model animals were taken. HE staining was used to observe the histopathological changes in different brain regions of the rats， and non-targeted metabonomics was utilized to analyze the different metabolites in the rat plasma and cerebral cortex， thus evaluating the damage degree.The average survival rates of rats in minor and serious groups were 83.2% and 73.7% （<0.05）， and the mean residual cerebral blood flow rates were 56.3% and 40.9%， respectively. The BBT scores at 2， 24 and 72 h after modeling in minor and serious groups were higher than those in sham group （<0.05）. The HE staining results showed that the neurons in the extensive cerebral cortex （especially in M1 and RSA）， ventrolateral part of ventromedial hypothalamus （VMHvl） and hippocampal C2 region showed morphological changes at different degrees. The non-targeted metabonomics analysis revealed a total of 45 differential metabolites in the plasma of sham and serious groups， comprising 33 up-regulated and 12 down-regulated metabolites. In addition， the RSA exhibited 19 differential metabolites， including 6 up-regulated and 13 down-regulated metabolites. This finding suggests that the modeling disrupted neuroendocrine function in the rats.The bilateral common carotid artery occlusion and open circulation model can lead to diffuse and extensive damage to the cerebral cortex， VMHvl， and hippocampal C2 region in rats， and the injury mechanism may be linked to metabolic disorders， oxidative stress damage， and other factors. This model provides a new experimental model for investigating repeated ischemia-reperfusion injury in rats with CSVD.

cerebral small vessel disease； ischemic stroke； ischemia-reperfusion injury； rat model

1000-4718（2023）07-1330-09

2022-09-30

2023-03-24

0731-88458257； E-mail： 68761083@qq.com

R363； R743； R-33

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.022

［基金项目］湖南省自然科学基金资助项目（No. 2020JJ5424）；湖南省教育厅青年基金资助项目（No. 21B0386）；湖南中医药大学中西医结合“双一流”学科开放基金资助项目（No. 2020ZXYJH08）

（责任编辑：李淑媛，罗森）