地衣芽孢杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

许 皓，冷森林，刘方圆，王萃瑜，刘 莹，袁 帅，张春宇

吉林特研生物技术有限责任公司,吉林长春 130122

近年来，面对抗生素的大量应用及其残留、细菌耐药水平不断增高等问题，为提高畜禽生产的经济效益，减少抗生素、替代抗生素，安全有效的饲料添加剂成为目前研究重点。益生菌是对人和畜禽有益的活性微生物。益生菌在畜禽等养殖方面具有广泛的应用[2,3,4]。地衣芽孢杆菌一种能产生内生芽孢的兼性厌氧革兰氏阳性杆菌，其可作为替代抗生素的饲用益生菌。本研究从肉牛的肠道、肺部及垫料中分离出地衣芽孢杆菌，并对其生物学特性进行研究，为实际生产提供依据。

1 材料

1.1 病例样本来源

辽宁省某大型牛场一头肉牛的肠道、肺部、垫料。

1.2 试验动物

18 只18 ～20 日龄18 ～22 g SPF 级ICR 小鼠购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.3 主要培养基及试剂

胰酪大豆胨琼脂、液体培养基均为北京奥博星生物技术有限责任公司的产品；生化鉴定管、药敏片均为杭州滨河微生物试剂有限公司的产品；细菌基因组DNA 抽提试剂盒、PCR 反应预混液Ex Taq ™、DL-3000Marker 为生工生物工程（上海）股份有限公司的产品；革兰氏染色液试剂盒为青岛海博生物公司的产品。

1.4 主要仪器

超净工作台（SW.CJ.2FD）购自上海博迅实业有限公司医疗设备公司；空气恒温摇床（KYC111）购自上海福玛实验设备有限公司；PCR 仪（T100TM Thermal Cycler）购自伯乐生命医学产品有限公司；光学正置显微镜（Axio Lab.A1）购自卡尔蔡司公司；DNA 电泳槽（DYCP-31DN）、稳压电泳仪（DYY-5）均购自北京六一仪器厂；凝胶成像仪（FR980）购自上海复日科技仪器有限公司；冷冻高速离心机（HC-2518R）购自BBI 公司。

2 方法

2.1 病料处理

用无菌剪刀在肺组织、肠道剪开一个切口，将灭菌棉签深入切口内取样，划线接种于TSA 培养基；同时将垫料用灭菌的生理盐水冲洗，用灭菌棉签蘸取液体，划线接种于TSA 培养基。

2.2 细菌分离、培养

37 ℃培养12 ～24 h 后观察，挑取各种优势菌落传代纯化，再培养12 ～24 h 后观察菌落形态。

2.3 细菌PCR 鉴定

2.3.1 DNA 制备。按照Ezup 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明进行提取DNA。

2.3.2 PCR 引物。27-F：AGTTTGATCMTGGCTCAG（5’-3’）；1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT（5’-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR产物约1 500 bp。

2.3.3 PCR 反应总体系25 µL：预混酶12.5 µL、上下引物 (10 µM)各1.0 µL、DNA 模版1.0 µL、ddH2O 9.5 µL。

2.3.4 按以下反应条件进行PCR 扩增，95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30 个循环，72 ℃延伸10 min。取PCR 产物5 µL，1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA 20 min 电泳观察。根据测序结果，在线生物学软件BLAST 进行NCBI 数据库搜索比对分析。

2.4 生化鉴定

按照文献采用细菌生化鉴定管对纯培养物进行生化鉴定，培养24 h，判定结果。

2.5 药敏试验

按照K-B 纸片扩散法进行药敏试验，进行(高敏S、中敏I、耐药R)结果的判断。

2.6 小鼠致病性试验

18 只小鼠，分为6 组，每组3 只；第1、3、5 组为攻毒组，分别注射菌液1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL，剂量分别为0.1、0.2、0.4 mL；第2、4、6 组为对照组，分别注射生理盐水0.1、0.2、0.4 mL。观察14 d，记录不良反应、精神状态、临床症状、采食情况及解剖后病理变化。

3 结果与分析

3.1 细菌的形态与培养特性

在TSA 培养基上培养12 ～24 h 菌落呈灰白色，表面平滑。菌落有时会形成放射状，呈边缘“毛刺状”的形态；革兰染色、镜检，分离菌株为革兰阳性杆菌。

3.2 PCR 鉴定结果及测序结果

对分离菌株16S rDNA 基因进行扩增，均扩增出大小为1 500 bp 左右的DNA 条带。将分离菌株所测16S rDNA 基因序列与GenBank 中已收录核酸数据库进行同源性检索，经比对后确定菌株为地衣芽孢杆菌，与登录号MT642946.1、CP033218.1 的地衣芽孢杆菌16S rDNA 序列同源性均为99.77%。

3.3 生化试验结果

采用细菌生化鉴定管对纯培养物进行生化鉴定，培养24 h，试验结果为：接触酶试验、甘露醇试验、阿拉伯糖试验、7%NaCl 生长试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验、葡萄糖试验结果均为阳性；尿素酶试验、靛基质试验、木糖试验结果均为阴性，以上结果与地衣芽孢杆菌特征基本符合。

3.4 药敏试验结果

药敏试验的判定标准参照药敏试纸厂家说明书，以及《抗菌药物敏感性试验执行标准》（M100-S19）和中华人民共和国卫生行业标准《纸片法抗菌药物敏感试验标准》（WS/T 125-1999）。药敏试验结果（表1）表明，该分离菌对阿莫西林、多粘菌素B、林可霉素均耐药；对阿米卡星、庆大霉素、头孢西叮、诺氟沙星、多西环素、恩诺沙星均为高度敏感；对氨苄西林、环丙沙星、甲氧苄啶均为中度敏感。

表1 分离株药敏试验结果

3.5 小鼠致病性试验结果

18只小鼠均没有出现不良反应，没有死亡现象，精神状态良好，采食良好。解剖后均没有病理变化。

4 讨论

本研究对所分离到菌株的菌体形态、细菌16SrDNA 基因测序分析方法、生化鉴定试验、药物敏感性试验、小鼠致病性试验等方法进行了系统鉴定，确定从肉牛的肠道、肺部及垫料中分离到的菌株为地衣芽孢杆菌。

在试验中，从地衣芽孢杆菌菌落形态上看，当培养基上的菌落个数较少时，菌落呈灰白色，表面平滑；当培养基上形成菌苔时，会向四周呈放射状。

药敏试验结果表明，该分离菌株对12 种抗生素的敏感度不同：对阿莫西林、多粘菌素B、林可霉素均耐药；对阿米卡星、庆大霉素、头孢西叮、诺氟沙星、多西环素、恩诺沙星均为高度敏感；对氨苄西林、环丙沙星、甲氧苄啶均为中度敏感。

小鼠致病性试验结果表明，三种浓度的地衣芽孢杆菌均对小鼠没有致病性，无不良反应，采食正常；对小鼠本身体质是否增强，有待进一步研究。

地衣芽孢杆菌是一种基本无毒、无残留、无抗性的益生菌，在饲料生产中可作为饲料添加剂。在畜禽肠道健康、免疫功能、生长性能等都有一定功效， 地衣芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱、耐胆碱、抗辐射等特点，决定了其在畜禽养殖过程中具有良好的应用前景，且有较高的应用价值。