孤独症谱系障碍患儿血清S100 钙结合蛋白B水平变化及其基因多态性观察

陈颖，闫淑媛，张梅，潘琳玲，匡晓妮

湖南师范大学附属长沙市妇幼保健院儿童保健中心，长沙 410007

孤独症谱系障碍（Autism spectrum disorder，ASD）是一组以认知功能受损为主要特点的神经行为障碍疾病，患病率1%～2%。最新调查发现，ASD的发病率逐年升高，并且男性发病率（3：1～5：1）显著高于女性［1］。ASD 的主要临床表现为社交缺陷、刻板行为和狭隘兴趣［2］。ASD 的发病机制错综复杂，可能与遗传、环境等诸多因素有关，早期诊断、早期进行康复训练是目前公认最有效的治疗方法［3］。ASD 的诊断主要依赖于医疗专业人员的行为观察，但ASD 的异常行为在出生12～18 个月时才逐渐表现出来，且因为评判人员水平差异等主观因素，容易出现误诊、漏诊现象。因此，寻找一个能够辅助诊断ASD 的生物标志物是目前的研究热点。S100 钙结合蛋白B（S100B）是一种主要由星形胶质细胞产生的钙结合蛋白，通过旁分泌和自分泌的方式，参与细胞内钙稳态、控制神经生成、支持突触发生、调控细胞周期和中枢神经系统的信号转导等［4］。既往研究［4］显示，S100B 是中枢神经损伤的生物标志物，S100B 基因rs1051169 位点多态性与多种神经发育障碍疾病有关。S100B 是否可作为ASD 的诊断标志物，目前相关研究较少。2021 年1 月—2023 年2 月，我们观察了ASD 患儿血清S100B 水平变化，分析血清S100B 水平对ASD 的诊断效能，观察S100B 基因rs1051169 位点的多态性，探讨S100B 基因rs1051169位点的多态性与发病有关。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2021 年1 月—2022 年8月在长沙市妇幼保健院确诊为ASD 的患儿78 例（ASD 组）。纳入标准：①严格按照美国精神障碍诊断与统计手册第五版（DSM-5）标准［5］，并通过详细的病史询问和查体以及现场两位经验丰富的医生使用儿童孤独症评定量表（CARS）确诊为ASD；②年龄2～6 岁；排除标准：①近半年内有神经相关药物的使用；②排除患有重大疾病者，如自身免疫性疾病、糖尿病、肝肾功能不全、白血病、恶性肿瘤等；③有神经发育障碍或脑损伤、家族遗传精神病史。同期随机选取健康体检的儿童80 例为对照组。ASD 组中男60 例、女18 例，年龄（40.64 ± 7.37）月；对照组中男53 例，女27 例，年龄（38.91 ± 6.67）月。两组年龄、性别具有可比性。两组监护人均已签署知情同意书，本项目在长沙市妇幼保健院伦理委员会已经获得批准。

1.2 两组血清S100B 检测 使用一次性采血管抽取两组静脉血2～3 mL，离心5 min（4 ℃，4 500 r/min），吸取上层血清，将上层血清分装保存于-80 ℃冰箱。采用ELISA 法检测血清S100B，所有操作均严格依据说明书上要求进行。重复检测3 次，取平均值。

1.3 两组患儿S100B 基因rs1051169 位点基因检测分析 采用聚合酶链反应联合DNA 直接测序法检测两组S100B 基因rs1051169 位点基因型。DNA 提取步骤严格依据说明书上要求进行。S100B 基因片段按PCR 条件及反应体系扩增，扩增后以Marker Ⅰ为核酸分子质量参照标准，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳于紫外灯下照相，扩增产物为目标片段。PCR反应体系：T3 Super PCR Mix 21 μL，上游引物1 μL，DNA 2 μL，下游引物1 μL。PCR 反应条件已通过预实验：98 ℃预变性2 min，（98 ℃ 10 s→61 ℃ 10 s→72 ℃ 5 s）×循环35 次，72 ℃终末延伸2 min，4 ℃保存。S100B 的基因片段扩增产物送铂尚生物技术有限公司进行基因测序，结果使用Chromas软件统计。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，性别及基因分型等计数资料以直接计数法及百分比表示，组间比较采用χ2检验，Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验是否具有群体代表性。绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析血清S100B 水平对ASD 的诊断效能。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿血清S100B 水平比较 ASD 组、对照组患儿血清S100B 水平分别为（0.356 ± 0.057）、（0.284 ± 0.058）ng/mL，二者比较，t=7.847，P＜0.001。

2. 2 血清S100B 水平对ASD 的诊断效能 血清S100B 水平诊断ASD 的ROC 曲线下面积（AUC）为0.808（95%CI为0.741～0.875），根据约登指数确定S100B 水平界值为0.351 ng/mL 时诊断ASD 的特异度为95%、灵敏度为58%。

2.3 两组S100B 基因rs1051169 位点基因型及等位基因频率比较 ASD 组和对照组S100B 基因rs1051169 位点基因型分布频率经检验符合Hardy-Weinberg 遗传平衡。S100B 基因rs1051169 位点多态性表现为C 突变为G，基因型为有CC、CG、GG，见图1。ASD 组S100B 基因rs1051169位点CC、CG、GG基因型分别为33、37、8 例，对照组S100B 基因rs1051169 位点CC、CG、GG 基因型分别为28、43、9例，二者比较，χ2=0.893，P＞0.05。ASD 组C、G 等位基因型频率分别为66%、34%，对照组S100B 基因rs1051169位点C、G 等位基因型频率分别为61.9%、38.1%，二者比较，χ2=0.590，P＞0.05。

图1 S100B基因rs1051169位点基因序列图

3 讨论

ASD 发病机制尚不明确，其诊断主要基于行为学诊断，缺乏明确、可识别的ASD 标志物，因此人们迫切需要寻找早期诊断ASD 的辅助方法。在过去十几年的研究使人们越来越了解到神经胶质细胞可能参与ASD 发病机制，其或与ASD 大脑特有的结构和异常的功能有关［6］。ZEIDAN 等［6］研究认为ASD可能是由于表观遗传基因调节和氧化应激的改变导致神经胶质相互作用失调的结果。S100B 主要集中在星形胶质细胞中，是星形胶质细胞活化的标志之一。目前，S100B 作为阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症或情绪障碍等疾病的可能生物标志物被积极研究［4］，但关于S100B 与ASD 的相关研究较少。本研究对78 例ASD 患儿和80 例健康儿童的S100B水平进行检测，ASD 患儿中S100B 水平显著高于健康儿童。进行ROC 曲线分析以评估S100B 在ASD早期诊断中的效用，AUC 为0.808（95%CI为0.741-0.875）。以不同S100B 水平作为界值点预测诊断ASD 的灵敏度和特异度，选择约登指数最大处为最佳筛查阳性界值；当S100B 为0.351 ng/mL，诊断ASD 的特异度为95%，敏感度为58%，具有一定的诊断效能。

ASD 患儿中S100B 水平升高的机制尚不完全清楚，研究发现自身免疫可能参与其中的发展［7］，学者在ASD 患者中发现了大脑特异性自身抗体，自身抗体可以通过血脑屏障与脑组织抗原结合，形成免疫复合物并导致神经元损伤，因此S100B 水平升高可能表明ASD 中的神经元损伤［8］。其次，S100B 可调节促炎因子分泌［9］。S100B 可激活一系列细胞信号通路，触发细胞内信号级联反应，调节多种炎症因子的释放（如IL-1β、IL- 6、IFN-γ 和TNF-α），支持神经炎症在ASD 发展中的作用［4］。S100B 可能还通过细胞凋亡影响ASD 的发病，AYAYDIN 等［10］报道S100B在神经细胞凋亡中起重要作用，S100B 对神经元具有营养和毒性双重作用，并且具有浓度差异性。在生理浓度下，S100B 可以起到保护神经的作用。当S100B水平过度升高时，S100B具有神经毒性并抑制神经元的增殖和分化，并诱导神经变性和细胞凋亡，这可能与ASD 的发病机制有关。但S100B 在ASD中的病理生理作用仍未研究清楚，期待未来能有进一步的研究。

遗传因素是ASD 的核心致病因素之一。随着研究的进展，已得知MTHFR、VDR、CNTNAP2 等基因多态性与ASD 的发病机制相关［11］，但是查阅文献发现S100B 基因多态性与ASD 的相关研究极少。S100B 基因位于q22.3 染色体上，其mRNA 长度为1095 bp，编码91 个氨基酸。S100B 基因多态性与多种神经发育障碍疾病有关，例如双相情感障碍、唐氏综合征、阿尔茨海默氏病和诵读困难等［12］。HOHOFF 等［13］发现S100B 基因多态性与S100B 的表达显著相关。WU 等［14］发现S100B 基因rs1051169 位点多态性与中国人精神分裂症的风险增加有关。本研究选取研究较多的S100B 基因rs1051169 位点，以78例ASD患儿及80例健康儿童为研究对象，探讨其与ASD 易感性的关系。研究发现ASD 组与对照组比较，S100B 基因rs1051169 位点基因型分布和等位基因频率差异均无统计学意义。但由于S100B基因有多个位点，本实验仅研究了其中的一个位点，因此S100B 基因多态性与ASD 的相关性还需进一步研究。

综上所述，ASD 患儿外周血S100B 水平升高，血清S100B水平诊断ASD有一定的灵敏度和较高的特异度，具有较大的临床应用价值；但S100B 基因rs1051169 位点与ASD 的易感性无关。本研究结果尚存在种族类别影响及样本量较小的问题，S100B水平及其基因多态性与ASD 的相关性，还有待进一步深入研究。