RP-HPLC法同时检测石榴皮3种多酚类提取物含量研究

范高福,韦梦强,吴 丹,方丽波,梁延波

(1.合肥职业技术学院生物工程学院,安徽 合肥 230012;2.上海海虹实业(集团)巢湖今辰药业有限公司质控科,安徽 巢湖 238000)

石榴(PunicagranatumL.) ,石榴科石榴属植物,又名安石榴、山力叶、丹若等,具有药食同源特性,源于中亚、东南亚地区,在我国被广泛种植,其中安徽怀远石榴作为国家地理标志产品,具有丰富的营养价值和保健功效[1]。当前石榴产业主要以品种改良、产品深加工为主[2],特别是废弃石榴皮再生利用备受关注,研究发现石榴皮功能部位中潜在安石榴苷(Punicalagin,PU)、鞣花酸(Ellagic acid,EA)、没食子酸(Gallic acid,GA)等多酚类生物活性物质,具有抗氧化、消炎杀菌、调脂降糖及防癌等多种药理作用[3-10]。当前针对石榴中鞣花酸、没食子酸或安石榴苷等单体提取物的检测方法较多[11-12],但关于安徽主产区石榴皮中安石榴苷、鞣花酸、没食子酸3种成分含量同时检测的方法尚未见报道,本次实验采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),对安徽本地的常见石榴品种的废弃皮部位提取物安石榴苷、鞣花酸、没食子酸3种多酚类成分建立同时检测方法,旨在为安徽本地及全国石榴产区废弃石榴皮部位进行多酚类成分检测提供补充方法。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

安徽怀远石榴购自安徽省蚌埠市怀远王氏榴园,经安徽中医药大学药学院彭华胜教授鉴定为石榴科石榴属石榴;安石榴苷对照品(纯度≥98%,Sigma-Alrdich公司);鞣花酸对照品(纯度≥98%,Sigma-Alrdich公司);没食子酸对照品(纯度≥98%,Sigma-Alrdich公司);Milli-Q超纯水,甲醇、乙腈为色谱纯;其余所需试剂均为分析纯;新鲜石榴皮干粉由实验室自制。

1.2 仪器与设备

Waters-e2695 HPLC系统:2998-PDA检测器(美国沃特世公司);Mnli-Q Biocel超纯水系统(美国密理博公司);JC-QX-3.2L型超声波清洗器(青岛聚创环保集团有限公司); R-1005型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司);FD-1C-50冷冻干燥机(上海比朗仪器有限公司);ME104E电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);HX-0508数显恒温水浴锅(江苏天翔仪器有限公司);SHZ-95B型实验室循环水真空泵(上海申生仪器抽滤真空泵厂);DGG-9030A型干燥箱(北京宏展仪器有限公司)等。

2 实验方法

2.1 实验方法

2.1.1 安石榴苷、鞣花酸和没食子酸检测的色谱条件

色谱柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相含甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0～9 min,94% B;9～21 min,94%～85% B;21～30 min,55% B;30～40 min,55%～45% B;40～48 min,94% B),甲醇冲柱 10 min,94% B平衡 30 min。流速1.0 mL·min-1,柱温30℃,检测波长272 nm,进样体积10 μL。在此色谱条件下,安石榴苷、鞣花酸、没食子酸特征峰峰型良好,无肩峰、拖尾等现象,其色谱图如图1所示。

1—没食子酸;2—安石榴苷;3—鞣花酸。(a)对照品

1—没食子酸;2—安石榴苷;3—鞣花酸。(c)红酸石榴皮样品图1 HPLC色谱图

2.1.2 安石榴苷、鞣花酸和没食子酸对照品溶液的制备

分别精密称取石榴皮提取物安石榴苷、鞣花酸、没食子酸各对照品适量,置入容量瓶,加60%甲醇稀释液定量,配制浓度分别为52.0 μg/mL,50.2 μg/mL,50.8 μg/mL的对照品溶液备用。

2.1.3 安石榴苷、鞣花酸和没食子酸检测的供试品石榴皮溶液的制备

取鲜石榴剥皮后收集,30℃干燥箱烘干粉碎处理后过筛,精密称取石榴皮干粉0.252 0 g,移入容量瓶中,加入60%甲醇稀释液25 mL,经超声(100 W,40 Hz)震荡摇匀30 min后称重,再用60%甲醇稀释液补缺,摇匀后抽滤取滤液,并经微孔滤膜(0.45 μm)精滤制得。

2.1.4 检测波长的选择

利用PDA检测器对安石榴苷、鞣花酸、没食子酸各对照品溶液进行全波长紫外扫描,测得吸收轮廓线图谱见图2。结果显示,安石榴苷在257 nm、358 nm和388 nm处有最大吸收,鞣花酸在254 nm和359 nm处有最大吸收,没食子酸在254 nm和359 nm处有最大吸收,未出现干扰峰,且分离度较好。根据相关文献[13-15],最终确定272 nm作为安石榴苷、鞣花酸和没食子酸同时检测的波长。

1—没食子酸对照品;2—安石榴苷对照品;3—鞣花酸对照品。图2 安石榴苷对照品、鞣花酸对照品、没食子酸对照品溶液轮廓线扫描图

3 结果分析

3.1 安石榴苷、鞣花酸和没食子酸检测的方法学考察

3.1.1 线性范围

避光环境下精密称取安石榴苷、鞣花酸、没食子酸各对照品干粉适量,置于棕色容量瓶中,加60%甲醇稀释液定容至50 mL,超声震荡后摇匀即得对照品母液,再用60%甲醇分别稀释得到不同质量浓度对照品混合溶液,安石榴苷溶液(浓度分别为209.92 μg/mL,104.96 μg/mL,52.480 μg/mL,26.240 μg/mL,13.120 μg/mL)、鞣花酸溶液(浓度分别为213.20 μg/mL,106.60 μg/mL,53.300 μg/mL,26.650 μg/mL,13.325 μg/mL)和没食子酸溶液(浓度分别为212.40 μg/mL,106.20 μg/mL,53.10 μg/mL,26.550 μg/mL,13.275 μg/mL),每个浓度均进样10 μL。以溶液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制安石榴苷、鞣花酸、没食子酸各对照品响应的拟合标准曲线,经测得安石榴苷回归方程为y=52 421x+70 824(r=0.999 9),鞣花酸回归方程为y=29 217x-32 100(r=0.999 9),没食子酸回归方程为y=34 094x+38 096(r=0.999 9)。实验结果表明,安石榴苷在13.120～209.92 μg/mL范围内与峰面积呈线性关系,鞣花酸在13.325～213.20 μg/mL范围内与峰面积呈线性关系,没食子酸在13.275～212.40 μg/mL范围内与峰面积呈线性关系。

3.1.2 高效液相色谱法系统适用性实验

精密量取安石榴苷、鞣花酸和没食子酸对照品溶液10 μL,连续进样上述剂量的对照品溶液6次,测得安石榴苷、鞣花酸和没食子酸的峰面积相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.6%、0.4%和0.3%。

3.1.3 稳定性实验

量取上述方法制备的石榴皮供试品溶液适量,分别在0,1,3,5,7,12,24 h各加样10 μL,测得供试品中安石榴苷、鞣花酸和没食子酸的峰面积RSD分别为1.2%、0.9%和0.6%。

3.1.4 精密度实验

称取等份石榴皮样品干粉6份,每份取样约 0.25 g,精密称定适量,制备供试品溶液,测得安石榴苷、鞣花酸和没食子酸的RSD分别为1.7%、1.4%和1.3%。

3.1.5 准确度实验

精密称取等份石榴皮样品6份,分别准确加入安石榴苷对照品适量,测定石榴皮供试品所含安石榴苷的质量并计算回收率,鞣花酸和没食子酸对照品同法操作,石榴皮部位中安石榴苷、鞣花酸和没食子酸回收率见表1。

表1 石榴皮中安石榴苷、鞣花酸和没食子酸回收率及RSD

3.2 样品含量测定

取安徽蚌埠市怀远产地石榴经典品种2种,分别为白玉石榴(A品种)和红酸石榴(B品种),制得石榴皮供试品待测溶液,采用外标法同时测定石榴皮部位中安石榴苷、鞣花酸与没食子酸的质量比,测试结果见表2。

表2 石榴皮中安石榴苷、鞣花酸和没食子酸的含量(n=3)

4 讨论

本实验通过反相高效液相色谱法同时检测安徽本地特色石榴功能部位皮中多酚类物质安石榴苷、鞣花酸、没食子酸含量,考察了不同溶剂、时间、温度条件下对样品石榴皮中安石榴苷、鞣花酸、没食子酸的提取效率的影响,结果表明,60%甲醇水溶液浸渍样品12 h,再超声(100 W)萃取45 min,提取回流温度60℃,有利于安石榴苷、鞣花酸浸出;而80%乙醇水溶液浸提处理,有利于没食子酸浸出;超声处理样品时长分别为30 min、60 min时,对应的石榴皮多酚安石榴苷、鞣花酸、没食子酸成分总量分别为8.11%、8.14%,对浸出率影响不大。此外,通过不同浓度(40%,60%,80%)的提取溶剂对石榴皮干粉进行浸提,结果发现此不同溶剂浸提回收率由高到低依次为甲醇、乙醇、丙酮,从而,优选甲醇溶剂。

通过PDA扫描,3个色谱主峰在272 nm 均有较强的紫外吸收且供试品溶液的杂质峰在此波长吸收较少,因此选择272 nm 作为检测波长。安石榴苷、鞣花酸和没食子酸均显弱酸性,当流动相pH值远远小于三个主成分的酸解离常数值时,这三种主成分主要以分子形式存在,因此选用磷酸溶液配比甲醇作为首选流动相,色谱柱规格为250 mm×4.6 mm,5 μm,推荐流速为1.0 mL·min-1,在选择进样量时,考虑到检测灵敏度,首选20 μL进样量,再逐步降低进样量到10 μL,三个主峰的峰型对称度和理论塔板数都很好,考虑到安石榴苷峰分为安石榴苷A和B组成,同分异构体在等度洗脱下难以分开,且分析时间较长,改为梯度洗脱:流动相含甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0～9 min,94% B; 9～21 min,94%～85% B; 21～30 min,55% B;30～40 min,55%～45% B;40～48 min,94% B)。分析方法学验证指标精密度良好(RSD<3%),溶液的稳定性实验中,对照品溶液放置室温条件下,在24 h内峰面积的RSD小于3%,准确度实验结果良好。检测图谱中安石榴苷存在同分异构现象,本次测算以总量计算。与相关文献[15-16]报道相比,提取液多使用醋酸乙酯及硼氢化钠前处理,且干扰因素多,本实验采用甲醇水溶液进行萃取,检测波长均为272 nm,流动相条件也较简单,整体实验操作简单,样品收率稳定且环境污染性小。

本实验采集了安徽怀远地区的不同优良品种石榴皮样品,并对样品有效成分的安石榴苷、鞣花酸、没食子酸总含量进行了测定,结果表明,与红酸石榴皮(B品种)相比,白玉石榴皮(A品种)所含安石榴苷和鞣花酸2种多酚类提取物的含量均有所增加,没食子酸含量不变,利于安徽本地石榴皮多酚类物质安石榴苷、鞣花酸、没食子酸质量同时检测。此外,本研究通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)初步建立了同时检测安徽地区主品种石榴皮多酚类物质含量的方法,可作为现行《中华人民共和国药典》中有关质量标准的有效补充,且检测方法灵敏度和准确度高。