鸟分枝杆菌感染流行特征和实验室诊断研究进展

宋 娟，刘 婷

(中国人民解放军陆军第八十二集团军医院 检验病理科，河北 保定 071000)

鸟-胞内分枝杆菌复合群(Mycobacteriumavium-intracellular complex，MAC)属于非结核分枝杆菌(non-tuberculousmycobacteria，NTM)，近年来MAC感染在全球范围内呈显著上升趋势。鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium，M.avium)是MAC的主要菌株之一，于1890年首次从一只患有肺空洞疾病的鸡身上分离出来，人类感染M.avium病例直到1930年才被报导。M.avium作为一种慢生长分枝杆菌，能够对抗宿主巨噬细胞的吞噬作用，可感染人体多个器官，导致肺病、淋巴结病、皮肤软组织病、骨病、播散性NTM病等多种疾病，以MAC肺病最为常见[1]。目前M.avium感染率不断上升，存在诊断难、治疗周期长、预后差、复发率高等问题。我们对M.avium感染的流行特征和实验室诊断进行综述，以期为M.avium的临床诊断提供参考。

1 M.avium流行特征

M.avium广泛存在于水和土壤中，并在管道中(如家庭和医院管道)增殖。M.avium能够合成长链脂肪酸(C60-C80)，构成疏水和不渗透的外膜，在配水系统、医疗设备和人类气道中形成生物膜，因此M.avium对消毒灭菌剂有较强的抵抗力和耐药性[2]。

M.avium为条件致病菌，人类主要通过呼吸道吸入、消化道摄入、皮肤接触来自环境中或医疗设备(未消毒或消毒不彻底)上的菌株引起感染。易感因素取决于宿主防御机制与环境中病原体暴露负荷及毒力之间的相互作用，其中机体免疫低下或免疫缺陷是M.avium感染的高危因素。研究显示[3-4]M.avium是AIDS患者感染NTM的主要病原体，感染率超过55%。可通过计数AIDS患者CD4+T细胞预测是否发生M.avium感染，CD4+T细胞<100×106/L的患者NTM感染率是CD4+T细胞>100×106/L患者的9.7倍[5]，当HIV感染者CD4+T细胞<10×106/L时，约40%的HIV感染者出现播散性NTM疾病[6]。除AIDS患者外，实体器官移植(solid organ transplantation，SOT)患者也是MAC感染的高危人群。2019年版《器官移植受者非结核分枝杆菌病临床诊疗技术规范》指出，SOT受者人群中NTM感染率约为1.5%～1.8%，其中86%约为NTM肺病，而鸟-胞内分枝杆菌是亚洲人NTM肺病最常见的致病菌(43%～81%)[7-8]。近年来研究发现γ-干扰素(IFN-γ)自身抗体免疫缺陷和白细胞介素-12(IL-12)通路遗传缺陷亦为播散性MAC肺病的易感因素[9-10]。易感因素还包括长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物，合并糖尿病、慢性支气管炎、肿瘤等基础疾病等。

由于鉴别NTM感染较为困难，导致不同研究中M.avium感染率不尽相同，与实验室诊断能力、公开报道范围及地区差异有关。在欧洲，M.avium在意大利、丹麦、葡萄牙的感染率分别为41.5%、50.7%、58.0%，高于其它NTM菌株[11]。在美洲，M.avium在美国、巴西、阿根廷的感染率分别为54.0%、33.3%、32.2%[12]。在非洲，2016年津巴布韦由NTM引起的肺疾病中MAC占比49.4%[13]。在亚洲，2007年日本MAC感染率是5.2/100 000，到2014年已增至13.1/100 000，其中日本北部和东部以M.avium感染多见，南部和西部则以胞内分枝杆菌多见[14]。韩国研究[15]表明M.avium感染率已占到NTM感染的88%。我国MAC感染以胞内分枝杆菌为主，M.avium感染率相对较低。Chien等[16]报道台湾地区M.avium感染率为15.2%，洪创跃等[17]报道台湾地区M.avium感染率为22.18%，季柏林等[18]报道浙江丽水地区M.avium检出率为16.05%，夏丹丹等[19]报道温州地区M.avium检出率为22.75%，李文彬等[20]报道湖南地区M.avium检出率为12.19%，张洁等[21]报道北京地区M.avium检出率为10.4%，周洪经等[22]报道天津地区M.avium检出率为9.57%，国内M.avium感染呈现出南方高于北方、沿海高于内地、气候温和地区高于寒冷地区的流行特点。

2 M.avium实验室诊断

2.1 显微镜检查和实验室培养

在结核病高发而实验室资源贫乏的地区，NTM感染主要通过涂片染色镜检抗酸杆菌的的方法进行诊断，优点是成本低廉、简便快速，缺点是灵敏度低，不能对分枝杆菌进行菌种鉴定。目前分枝杆菌培养仍是检测NTM感染的金标准，来自肺内和肺外的标本，如痰液、支气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液、肺活检组织、淋巴结活检组织、肝脏活检组织、肾脏活检组织、脾脏活检组织、血液、骨髓分泌物、体液和粪便等均可进行NTM培养。我国主要采用对硝基苯甲酸(PNB)培养基进行细菌培养，绝大多数NTM菌种能够在500 mg·L-1的PNB罗氏培养基中生长，结核分支杆菌正与之相反，但该方法培养时间长，一般需要10 d左右，如需继续鉴定和药敏实验，时间会延长至数周。NTM生长速度、菌落形态、色素沉着和生化试验(如烟酸、硝酸盐测定)有助于进一步识别MAC。尽管MAC菌落呈现出广泛的菌落变异性，如从光滑到粗糙，从无色到奶油色再到亮黄色，但其它多种分枝杆菌也有此特点，菌种鉴定准确性很低，需结合其他方法进行鉴定。

需要注意的是，不同临床标本分离培养得到的NTM菌株临床意义不同。血液、淋巴结、骨髓、肝脏、肾脏和脾脏等部位的标本分离得到的NTM往往为致病菌，而从痰、支气管冲洗液、肺泡灌洗液中分离得到的NTM，则需排除标本污染或呼吸道定植的可能。应综合分析是否具有典型影像特点、是否符合诊断细菌学标准(痰标本至少两次培养得到鸟分枝杆菌；至少一次支气管冲洗或灌洗培养得到鸟分枝杆菌；肺活检有典型分枝杆菌病理学改变并培养得到鸟分枝杆菌)、是否排除其他肺部疾病(尤其是肺结核)等。

2.2 分子生物学鉴定

利用分子生物学技术可以直接从分离株或临床样本中提取鸟分枝杆菌的DNA进行鉴定，快速准确，是目前进行NTM菌种鉴定的主要方法。聚合酶链式反应(PCR)是最常用的技术，NTM移动基因组元素(即插入序列，IS)可作为PCR的靶点，其中IS1311、IS900、IS901、IS1245是M.avium检测最常用的DNA靶序列，其中以IS1245序列为探针的限制片段长度多态性分析(RFLP)是M.avium基因分型的标准方法，这一插入序列从未在其他18种常见的NTM中被识别过。此外，16S rRNA基因测序法检测NTM快速、准确，是检测NTM比较权威的方法。荧光PCR熔解曲线法是根据不同分枝杆菌基因转录间隔区(intergenic transcribed spacer，ITS)片段的特异序列设计探针，采用特定的荧光通道和熔点进行分枝杆菌鉴别的新方法，与16S rRNA基因测序法具有较高的一致性，对仪器、实验人员要求更低，价格也更便宜，适宜临床常规开展[23]。

近年来通过宏基因组二代测序技术(me-tagenomics next-generation sequencing，mNGS)技术诊断NTM病的报道逐渐增多，孔娇等[24]发现对患者呼吸道标本行mNGS检测即可明确NTM病原菌种类，对肺部NTM诊断的敏感度较高，可直接鉴定菌种，但特异度较低，应重点提高检测特异度。缪青等研究指出[25]，mNGS在肺泡灌洗液和组织样本中的阳性率较高，在痰液标本检测中的阳性率不及痰培养，可能与痰液中大量口咽部定植菌导致NTM序列检出数量明显下降有关，认为mNGS检测NTM的理想样本为肺泡灌洗液和组织。

全基因组测序技术(WGS)是分子生物学领域的最新突破，可以识别物种多样性和菌株特异性的遗传决定因素，研究可能与NTM的抗生素耐药性、毒性和/或宿主关系相关的多个遗传区域。尽管WGS还未在临床上广泛应用，但有可能发展成为M.avium遗传特性鉴定的精准工具。

2.3 血清学检测

2.3.1 抗GPLs抗体检测

血清学诊断MAC感染最常用的方法是酶免疫分析法(enzyme immunoassay，EIA)，这种方法以MAC细胞壁特有的糖肽脂类物质(glycopeptidolipids，GPLs)核心为抗原，检测患者血清中相应的GPLs核心抗体。研究者通过抗体定量分析发现，MAC肺部感染患者血清中抗GPLs抗体(IgG、IgA和IgM)含量升高，而其他类型分枝杆菌(如结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌)肺部感染者和正常人群没有这种变化，其中IgA检测敏感性和特异性最高，分别为84%、100%。Jhun等[26]研究指出高水平的IgA表明疾病可能处于活动期，其含量变化有助于评估MAC患者的治疗效果；该研究同时提出，IgA定量分析可能成为区分临床呼吸道分离出的M.avium是感染还是定植的重要评价指标。Matsuda等[27]研究也指出，需要治疗的复杂性NTM肺病患者血清抗GPLs核心IgA抗体阳性，抗体滴度与疾病进展高度相关。

2.3.2M.avium蛋白检测

利用鸟分枝杆菌MAV-2054、MAV-5183、MAV-2753等蛋白抗原进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，通过检测血清中相应抗体，发现MAC肺病患者抗MAV-2054、MAV-5183 MAV-2753的IgG抗体滴度明显高于肺结核患者和健康对照者，认为多重蛋白抗原联合检测对筛查鸟分枝杆菌肺部感染病例，特别是涂片培养阴性或PCR结果阴性的病例非常有价值[6]。

2.4 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术

2.4.1 蛋白质基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

MALDI-TOF-MS蛋白质检测技术是通过微生物中提取的肽和蛋白质成分获取指纹图谱，实现微生物鉴定、分型的新方法，已迅速取代传统生化和表型分析鉴定方法，在临床微生物领域获得广泛应用，具有操作简便、结果快速准确等优点。周亚娣等[28]利用MALDI-TOF-MS技术对NTM菌种进行分型，与基因测序分型鉴定结果比对，发现MALDI-TOF-MS技术对NTM分型准确率为98.4%，表明该技术在NTM鉴定中可发挥重要作用。需要注意的是，分枝杆菌细胞壁组成成分复杂且稳定，胞内核糖体蛋白质难以释放，指纹图谱难以获取，易导致分枝杆菌鉴定失败。研究指出[29-30]，95 ℃ 30 min加热处理，0.5 mm直径的玻璃珠漩涡震荡或研磨，使用改良甲酸提取等方法处理分枝杆菌均有助于细菌破壁释放蛋白质，提高质谱鉴定成功率和准确率。此外，目前已发现NTM 190余种，MALDI-TOF-MS数据库能够涵盖NTM的种类将直接影响NTM鉴定结果。徐茂锁等[31]指出MALDI-TOF-MS自建数据库可补充商品数据库外的预测图谱信息，对数据库进行有效完善，能够提高鉴定准确率。

2.4.2 核酸基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

MALDI-TOF-MS蛋白质检测技术需要进行分枝杆菌培养，无法达到快速诊断的目的。而MALDI-TOF-MS核酸检测技术以核酸作为细菌鉴定的生物标志物，通过对多靶点基因片段进行多重PCR特异性扩增。经处理后的延伸反应产物同质谱基质混合，放入质谱仪中运行，得到独特的指纹质谱图，经过判读后可获得菌种及耐药信息。已有研究[32-33]证实MALDI-TOF-MS核酸检测技术鉴定分枝杆菌及其耐药性，敏感度、特异度和准确性都达到了较高水平，具有较好的诊断价值和临床应用前景。《核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术在结核病和非结核分枝杆菌病诊断中的临床应用专家共识》(以下简称《专家共识》)指出[34]，核酸MALDI-TOF-MS技术可鉴定40个NTM菌种及其亚种，可检测NTM大环内酯类(阿奇霉素、克拉霉素)和氨基糖苷类药物(卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素)的耐药基因型。《专家共识》建议，对于高度疑似NTM肺病的患者，应及早送痰和(或)支气管肺泡灌洗液进行MALDI-TOF-MS核酸检测，以快速鉴定致病菌。而对于鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和脓肿分枝杆菌等致病性NTM所致NTM肺病和肺外NTM病患者，应及早送MA LDI-TOF-MS核酸检测技术进行耐药性检测。

3 总 结

M.avium感染率高，流行特征也在不断变化，如何进行快速准确的鉴定一直是临床研究的重点。此外，如何识别M.avium感染风险增加的患者，探寻筛查潜在M.avium感染的方法都是今后研究的方向。临床和实验室人员应不断加强学习，积累经验，积极应对M.avium感染带来的严峻挑战。