体外共培养诱导人羊膜上皮细胞向软骨细胞分化的初步研究

王康，智晓东，张玉强，张文景，王伟

作者单位： 315040 宁波，宁波大学附属人民医院（王康）；锦州医科大学附属第一医院（智晓东、张玉强、张文景、王伟）

骨关节炎（OA）的治疗关键在于软骨再生，但是目前药物治疗、物理治疗对于早中期OA 的治疗并没有逆转病程进展的确切疗效[1]。近些年来，干细胞治疗OA 的良好效果受到了普遍的关注[2]。常用的干细胞包括脂肪间充质干细胞（ADMSCs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）及脐带间充质干细胞（UCMSCs）等[3-4]，但目前仍存在着许多局限性。人羊膜上皮细胞（hAECs）是近年来在干细胞治疗领域广受关注的“种子细胞”之一[5]。hAECs 较其他干细胞取材方便、来源丰富、免疫原性低，且hAECs 具有非致瘤性，应用更具安全性[6-7]。虽然以往有研究通过添加各种诱导试剂成功诱导了hAECs 软骨分化，但是这种诱导方法过程繁琐，而且无法在体外研究移植hAECs 至关节腔后与软骨细胞的相互作用[8]。而基于transwell 小室的共培养技术诱导方法具有操作方便、成本低和可建立研究两种细胞相互作用模型的优势。本研究以hAECs为前体细胞，在体外培养条件下，定向诱导分化为软骨细胞，以探讨其在OA细胞疗法上的应用前景，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料来源 人关节软骨细胞购买于ProCell 公司，批号202102254。剖宫产后的羊膜收集自锦州医科大学附属第一医院妇产科，并获得伦理委员会批准。排除胎儿畸形，产妇先天性遗传病，及甲型肝炎、乙型肝炎、HIV、梅毒等传染病史，产妇术前签署了知情同意书。

1.2 hAECs的原代分离、纯化、培养以及传代 用镊子及直钳将羊膜从胎盘钝性剥离下来，0.9%氯化钠溶液洗净。用含100 U/ml 盘尼西林、100g/ml 链霉素的PBS 液200 ml 漂洗羊膜组织2 ～3 次，除去血细胞，2 h 内处理标本。从PBS 中取出羊膜，沥干多余水分，置于灭菌培养皿中，剪成3cm2左右，挪至10cm培养皿中。加入0.25%胰酶20ml，剪碎，转移至细胞筛网中，用瓶底研磨10 min，37 ℃恒温水浴锅中消化30 min，用200 目钢网过滤以去除组织块。加入5 ～10 ml FBS 中和胰酶，收集细胞悬液。未消化的羊膜组织可以继续用胰酶消化2 ～3 次。所有的细胞悬液，1200r/min 离心3min，弃上清，培养液重悬沉淀。台盼蓝计数，以1×105/cm2接种到直径为10 cm 的培养皿中。置体积分数为37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养2 h 后轻轻将未贴壁的细胞吸出，再接种于新培养皿中。在饱和湿度、37 ℃、5%CO2培养箱静置培养，48 h 后首次换液，待细胞达80%～90%融合时，用0.25%胰酶/0.02%EDTA 消化传代培养。

1.3 免疫组化鉴定hAECs 取第3 代hAECs，将细胞稀释至细胞浓度为2×107个/L，将1 ml 细胞悬液接种于培养皿中培养。24 h 后PBS 洗涤3 次，多聚甲醛固定，PBS 洗涤5 min；通透20 min，PBS 洗涤5 min×3 次。封闭，滴加一抗CK19（1∶1 000）或波形蛋白（1∶1 000），4 ℃过夜，PBS 洗涤5 min×3 次。滴加二抗（1∶100），孵育1 h，PBS 洗涤5 min×3 次。滴加DAPI 避光孵育5 min，PBS 洗涤5 min×3 次；封片，镜下观察。

1.4 流式细胞仪鉴定hAECs 取第3 代hAECs，将细胞浓度调整为1×105个/ml，离心，弃去上清液，将预先准备好的0.3%BSA 溶液加入EP 管中，每管200l，室温密封30 min，弃上清，加入小鼠抗人单克隆抗体分化簇CD73、CD90、CD105、CD29、CD34、CD45、SSEA-4 和HLA-DR，4 ℃静置20 min。上机检测细胞表型，IgG-PE 作阴性对照。从10 000 个活细胞中获取数据，并使用FCS Express 软件分析结果。

1.5 软骨细胞与hAECs 间接共培养体系的构建选择0.4m 的24 孔板transwell 小室。实验分为两组，实验组：在24 孔transwell 系统的上腔中接种4×104个自体关节软骨细胞（ACs），在培养板中接种了1×104hAECs。对照组：在24 孔transwell 系统的上腔中接种4×104hAECs，在培养板中接种1×104hAECs。每组有3 个复孔。将孔板置于37 ℃，5%CO2培养箱，每2 天更换一次培养基（含10%FBS的DMEM/F12培养基），诱导21d后行后续实验，见图1。

图1 hAECs 与ACs 共培养系统

1.6 甲苯胺蓝染色 将1.5 中所述的hAECs 共培养21 d 后，弃去培养基，PBS 洗涤3 次，40 g/L 多聚甲醛固定10min。PBS 洗涤3 次，0.1%甲苯胺蓝工作液常温染色30min。弃去染料，蒸馏水冲洗干净，镜下观察。1.7 免疫组化染色 将1.5 中所述的hAECs共培养21 d 后，制作细胞爬片，40 g/L 多聚甲醛固定30 min后，PBS 清洗3 次，每次5 min；3%的H2O2避光室温封闭30 min；蒸馏水洗3 次；封闭，置于湿盒；滴加适当浓度（1∶100）的一抗，4 ℃过夜；37 ℃复温30 min，PBS 洗3 次，每次5 min；滴加生物素化二抗（1∶200），置于湿盒，37 ℃孵育30 min。滴加辣根过氧化物酶，孵育40 min。PBS 洗3 次，每次5 min；DAB显色，苏木精复染；体积分数1%盐酸乙醇分色数秒，乙醇梯度脱水，封片，镜下观察。

1.8 Western-bolt 检测软骨细胞标志物 将1.5 中所述的hAECs 共培养21 d 后，弃培养基，用4 ℃预冷的PBS漂洗后，用Trizol 法提取蛋白质，经定量后取60g蛋白质，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，显影。COL1、COL2、AGGRECAN 和SOX9 一抗工作浓度为l∶500，GAPDH 一抗工作浓度为1∶1 000，4℃孵育过夜。滴加二抗山羊抗鼠IgG（1∶1 000），室温孵育2 h。加入A、B 液（ECL 系统）后化学发光，使用Quantity One 分析软件（BIO-RAD公司，美国）进行蛋白条带的定量分析，AU（area density）代表条带的面积×荧光强度，以各种蛋白/GAPDH 的AU 比值代表各自蛋白的相对含量。

1.9 RT-qPCR检测软骨细胞标志物 将1.5 中所述的hAECs 共培养21 d 后，弃培养基。用4 ℃预冷的PBS漂洗后，依次加入RNA提取液、三氯甲烷、异丙醇及75%乙醇等，提取总RNA，并测量总RNA的纯度和浓度。按照逆转录反应体系进行逆转录，使用GAPDH 作为内参进行PCR 扩增，95 ℃，预变性10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s 循环40 次，60 ℃→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃制作熔解曲线。采用2-CT法计算ACs标志物COL1、COL2、AGGRECAN 和SOX9 mRNA的相对表达量，引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列

1.10 统计方法 使用SPSS 25.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，两组比较使用Student’s t检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hAECs的形态学观察和鉴定 接种后2 ～3 d，细胞黏附在壁上，原代细胞（P0）呈现散在细胞团生长，具有很强的折射率，第3 代细胞（P3）hAECs呈现典型铺路石样的上皮细胞形态，见图2a；免疫荧光染色显示CK19 强表达，Vimentin 弱表达，见图2b。流式细胞术检测hAECs 表面标志物的表达，结果显示CD73、CD90、CD105、CD29 和SSEA-4 呈阳性，CD34、CD45 和HLA-DR 呈阴性，见图2c。

图2 hAECs 鉴定

2.2 共培养后hAECs 形态学观察、免疫组化和甲苯胺蓝染色 诱导共培养21 d 后，对照组hAECs 无明显变化，依然呈现典型的铺路石样改变；而实验组中的细胞则处于软骨形成分化阶段，呈现散在三角形或多角形形态。免疫组化和甲苯胺蓝染色显示COL2 和AGGRECAN出现大量表达，而对照组无表达，见图3。2.3 共培养后hAECs 中软骨细胞特异性蛋白相对表达量 实验组软骨细胞特异性蛋白COL2、COL1、AGGRECAN和SOX9 表达量均明显高于对照组（均P ＜0.05），见图4。

图3 共培养后hAECs 分化鉴定

图4 Western-bolt 检测共培养后hAECs 软骨特异性蛋白COL1、COL2、AGGRECAN 和SOX9 的表达情况

2.4 共培养后hAECs 中软骨细胞特异性mRNA 相对表达量 实验组中软骨细胞COL1 mRNA、COL2 mRNA、AGGRECAN mRNA 和SOX9 mRNA 表达量均明显高于对照组（均P ＜0.05），见图5。

图5 RT-qPCR 检测共培养后hAECs 中COL2 mRNA、COL1 mRNA、AGGRECAN mRNA 和SOX9 mRNA 的表达情况

3 讨论

关节软骨组织本身可以在一定程度上再生，包括软骨细胞、软骨基质和弹性纤维，但再生过程缓慢[9]。有研究证明hAECs 可在特定环境下向结膜上皮细胞、肝细胞样细胞、多巴胺能神经元、角膜上皮细胞和腺泡细胞等分化[10]；另一方面，hAECs 来源广泛，分离培养方法相对简单，体外培养性状稳定，适合进行体外实验及临床实验研究。

本实验应用酶裂解法分离出hAECs，分离方法简单易行，体外培养的hAECs具有较强的增生能力，多次体外培养传代后增生能力和分化潜能也不会发生明显的改变。本实验提取的hAECs 呈现典型铺路石样的上皮细胞形态，免疫荧光染色显示CK19 强表达，Vimentin 弱表达。流式细胞术检测hAECs 表面标志物的表达，结果显示CD73、CD90、CD105、CD29 和SSEA-4 呈阳性，CD34、CD45 和HLA-DR呈阴性，与以前的研究结果一致[11]。

本研究初步探讨了ACs 通过transwell 小室相隔与hAECs 共同培养，诱导hAECs 分化为ACs 的可能性。本研究选择第3 代hAECs 和ACs 进行下一步共培养，因为传至第3 代的上皮细胞具有更快的增殖速率和更好的生存力，适合于诱导分化实验。结果表明共培养21 d 时hAECs 呈现ACs 典型的三角形或多角形的形态，免疫组化和甲苯胺蓝染色提示实验组COL2 和AGGRECAN 表达相对于对照组明显增高，Western-bolt 和RT-qPCR 分析显示实验组COL1、COL2、AGGRECAN和SOX9 相对于对照组明显增高。本研究用于hAECs 和ACs 共培养的培养基是适合ACs 生长的特殊培养基，但对照组没有发现明显的变化，这表明hAECs 的软骨转化不是培养基引起的，很可能在共培养过程中分泌了一些诱导hAECs分化的物质，它们提供的微环境可以促进hAECs的分化。本研究对进一步优化体外诱导hAECs 向ACs 具有重要意义，并为相关实验提供了研究模型。

本研究为软骨组织工程研究提供了新的细胞来源；然而，仍需要进一步深入研究，如定向调控影响hAECs 向软骨细胞诱导分化的各种因素，探究hAECs 修复软骨组织的机制的基础上结合支架材料、细胞因子等，保持促进与抑制定向分化维持动态平衡以及细胞移植的安全性、可行性和组织工程潜在的免疫原性等问题。因此，需要进一步深入研究，建立一套标准的干细胞治疗体系，以期能更好的应用于临床。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 王康：实验设计、实验操作、统计分析、论文撰写；智晓东：实验指导、数据整理；张玉强、张文景：细胞培养、实验检测；王伟：研究指导、论文修改、经费支持