多黏菌素B中多种单体的制备

朱鑫磊 江锡铭 黄臻辉

(上海上药第一生化药业有限公司 200240)

多黏菌素B 是一种由多黏芽孢杆菌发酵产生的碱性高分子多肽类抗生素，对革兰阴性菌有强效杀菌作用，但因有肾毒性和神经毒性，过去使用较少。随着超级耐药菌的出现，多黏菌素B 被再次启用，作为治疗泛革兰阴性菌感染的最后选择[1-3]。其组成较为复杂，包含多种单体[4-9]，文献虽然提及相关分离纯化工艺，但未涉及运用高效液相分离各主要单体的内容。本文阐述运用高效液相色谱分离硫酸多黏菌素B 中各单体及其制备过程，为硫酸多黏菌素B 成分研究及临床使用提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 仪器与主要试剂

1260 分析型高效液相色谱仪（Agilent 公司）；SD-1制备型高效液相色谱仪（Varian 公司）；FE20 pH 计（Mettler Toledo 公司）；真空冷冻干燥机（上海东富龙制药设备制造有限公司）；SolariX 7.0T 型傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（Bruker 公司）。

硫酸多黏菌素B 原料药（武汉汇海医药有限公司）、乙腈（星可高纯溶剂有限公司，制备级）、磷酸（Fisher公司，HPLC 纯）；水为本公司自制纯化水。

1.2 高效液相色谱分析

参考中国药典（2015 年版）硫酸多黏菌素B 项下的分析方法[4]，选择Diamonsil Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪马科技公司），以硫酸钠溶液（4.46 g 无水硫酸钠溶解在900 mL 水中，用磷酸调节pH 至2.3 后用水定容至1 L）-乙腈（78 ∶22）为流动相，等度洗脱，流速为1 mL/min；柱温30 ℃；进样量20 μL，检测波长215 nm。

1.3 硫酸多黏菌素B 成分分析

多黏菌素B 是微生物发酵产物，由一系列结构类似的环脂肽化合物组成，其主要单体包括有效成分多黏菌素B1和B2、主要杂质B3和Ile-B1、其他已知杂质B6和Ile-B2及一些未知单体（图1）。其中多黏菌素B1、B2、B3、Ile-B1、Ile-B2及B6的骨架结构基本相同，仅在两个取代基上有所不同（图2，表1）。

表1 多黏菌素B各单体的化学结构区别

图1 硫酸多黏菌素B各单体色谱图

图2 多黏菌素B的化学结构图

1.4 各单体制备液相分离纯化

1.4.1 初步分离

称取3 g 硫酸多黏菌素B 原料药，用纯化水溶解，制备成质量浓度为600 mg/mL 的溶液，通过制备液相进行初次制备分离。

Kromaisl 10-100 C18制备色谱柱[50 mm×250 mm，10 μm；安捷伦科技(中国)有限公司]；流速100 mL/min；检测波长λ=215 nm，流动相A1：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸调节pH 至2.43），B：乙腈；按表2 进行初次洗脱。分管收集洗脱峰为B1、B2、B3、Ile-B1、Ile-B2与B6的初次分离产物溶液，HPLC 测定后，分别合并纯度大于80%的收集液，待进一步纯化。

表2 初次分离梯度洗脱

部分收集液浓度低，体积大，可采用先上柱富集再梯度洗脱（表3），经旋转蒸发仪减压除去乙腈后，再上样纯化。体积小的部分通过加水稀释，将乙腈浓度降至12%以下后直接上样纯化。

表3 富集梯度洗脱方法

1.4.2 多黏菌素B1

Kromaisl 10-100 C18制备色谱柱（50 mm×250 mm，10 μm；自装）；流速100 mL/min；检验波长λ=215 nm，流动相A2：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用2.5 mol/L H2SO4调节pH 至2.92），B：乙腈；按表4 进行梯度洗脱。合并纯度大于95%的收集液。

表4 B1梯度洗脱

1.4.3 多黏菌素Ile-B1与B3

Ile-B1与B3的初次收集液分别通过反相高效液相色谱进行二次纯化，收集洗脱峰。层析条件同1.4.2，按表5 梯度洗脱，合并纯度大于98%的收集液。

表5 Ile-B1与B3梯度洗脱

1.4.4 多黏菌素B2

B2收集液（纯度约87.6%)，先经制备柱进行富集，洗脱液经旋转蒸发仪减压除去乙腈后，采用Kromaisl 7-100 C18制备色谱柱（50 mm×250 mm，7 μm；自装），流动相A3：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸调节pH 至3.5），按表5 梯度洗脱，合并纯度大于98%的收集液。

1.4.5 多黏菌素Ile-B2

合并纯度>95%的收集液，分多次上柱纯化。采用UniPS 5-300 C18AQ 制备色谱柱（21.2 mm×250 mm，5 μm；纳微科技公司），流速20 mL/min，流动相A4：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸调节pH 至2.54），按表6 梯度洗脱，合并纯度大于99%的收集液。

表6 Ile-B2梯度洗脱

1.4.6 多黏菌素B6分离纯化

合并纯度>95%的收集液，分多次进行纯化。层析条件同1.4.5，按表7 梯度洗脱，合并纯度大于97%的收集液。

表7 B6梯度洗脱

2 结果

2.1 相关单体的检测结果

各单体的收集液，经减压浓缩去除乙腈后，冷冻干燥，获得6 个单体（表1）。通过ESI-MS 检测，表明各单体的相对分子质量的检测值与理论值相符（表8），确认是目标单体，经HPLC 分析（图3），纯度均大于96%，可供相关质量研究使用。

表8 各单体ESI-MS检测

图3 多黏菌素B各单体HPLC谱图

2.2 初次纯化条件的优化

为提高工艺效率，在保证各单体分离度的条件下，须尽可能提高单次上样量。当单次上样量达到3 g 时，已经出现B2、B3单体难以分离的情况。故最初次制备分离的上样量为每次3 g。

通过实验对比，发现在相同的洗脱条件下，采用UniSil C18AQ（21.2 mm×250 mm，10 μm；纳微科技公司）的制备柱和100 mg/mL 的硫酸多黏菌素B 上样液，经反相制备液相纯化，以流动相A（磷酸调节pH 至3.2）-B（78.5 ∶21.5）等度洗脱，单体Ile-B2与B6的分离效率较佳。

3 讨论

本研究发现，相同洗脱条件下，降低流动相A 的pH 可使部分单体的出峰时间提前；精制时，适度调整其酸度能取得更好的纯化效果。另外，使用磷酸调节流动相A 的pH 时，制备液相图谱峰型优于使用硫酸。Ile-B2和B6出峰时间相近，在实际操作中使用磷酸调节流动相A 的pH，其分离效果好于硫酸，能使两者更好地分离。

本研究建立了一种通过反相液相色谱法直接从硫酸多黏菌素B 中分离出各高纯度单体的方法，相比定向合成对应的单体，省时、高效、经济，可重复性强，设备和材料需求低。所制备的样品纯度均大于96%，符合相关质量研究的要求，能降低企业相关质量研究的成本，为本公司开展产品“硫酸多黏菌素B”的相关临床研究提供了技术支持。

致谢：上海交通大学分析测试中心桂娟老师帮助完成各单体的质谱数据分析。