基于HPLC-CAD法对罗汉果配方颗粒特征图谱的研究

杨学芳 苏万福 吴 菲

（1.济川药业集团有限公司，江苏 泰州 225441；2.扬子江药业集团有限公司，江苏 泰州 225321）

罗汉果为葫芦科植物罗汉果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang 的干燥果实，味甘、性凉，归肺、大肠经，具有清热润肺、利咽开音、滑肠通便的功效［1］，作为卫生部首批公布的药食同源的中药材之一，其素有“良药佳果”之称。罗汉果本身含有三萜苷类、黄酮类、多糖类、油脂类等多种化学成分，研究结果［2，3］表明，其具有润肺止咳、润肠通便、降糖调脂、保肝、抗氧化等多种药理作用。临床上多用于治疗支气管炎、肺炎、哮喘、高血压病等疾病，此外还可防治冠心病、血管硬化、肥胖症等。

罗汉果配方颗粒是以罗汉果饮片为原料，经现代制药技术提取、浓缩、干燥、制粒而成的供临床配方用的颗粒剂。与传统汤剂相比，配方颗粒不但可以满足医生辨证论治、随证加减的需求，还省去了每次煎煮的繁琐步骤，并且方便保存和携带；对患者而言，因服用量少，故依从性也有较大改善［4，5］。虽然配方颗粒在临床应用上有很多优点，但其质量控制方面还处于不断完善的过程［6］。目前已有报道的罗汉果配方颗粒的质量研究为薄层鉴别及单一含量的质量控制［7］，而从药物整体进行的特征图谱研究未见报道。本文采用高效液相色谱-电喷雾检测（HPLC-CAD）法建立了基于标准汤剂［5，8］的罗汉果配方颗粒特征图谱的检测方法［9，10］，能够对罗汉果配方颗粒的质量进行更为全面的控制和整体评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器Thermo U3000高效液相色谱仪，四元泵，配置CAD 检测器，Chromeleon 7.2 SR5 色谱工作站（赛默飞世尔科技有限公司）；SY8200-T 超声波清洗机（上海声源超声波仪器设备有限公司）；XSE205DU 电子天平（METTLER TOLEDO）。

1.2 试药罗汉果对照药材（批号121020-201306）和罗汉果皂苷Ⅴ对照品（批号111754-201703）均购于中国食品药品检定研究院；罗汉果标准汤剂（自制，批号190322、190324、190326、20200820、20200821、20200822、20200823、20200824、20200825、200401、200402、200403、200404、200405、200406，前9 批饮片产地为广西，后6批饮片产地为广东）；罗汉果配方颗粒（自 制，批 号 1906013、2003013、2003023、2003033）。甲醇（默克股份两合有限公司，批号I1082407013，每瓶4 L）、乙腈（默克股份两合有限公司，批号JA089730，每瓶4 L）均为色谱纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照药材及对照品参照物溶液取罗汉果对照药材1.0 g，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率720 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另精密称取罗汉果皂苷Ⅴ对照品10 mg，置100 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，作为对照品参照物溶液。

2.1.2 供试品溶液取本品适量，研细，取约1.0 g，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率720 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验采用Agilent Po⁃roshell 120 HILIC-Z（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱；乙腈-甲醇（9∶1）为流动相A，水为流动相B，线性梯度洗脱（0～3 min，97%A；3～5 min，97%A→90%A；5～10 min，90%A；10～23 min，90%A→65%A；23～25 min，65%A→5%A；25～35 min，5%A；35～38 min，5%A→97%A；38～45 min，97%A）；流速为0.9 mL/min；柱温为25 ℃；电喷雾检测器（CAD），雾化温度为35 ℃。对照品参照物溶液进样10 μL，对照药材参照物溶液及供试品溶液进样5 μL。

2.3 精密度试验取罗汉果配方颗粒1.0 g（批号1906013），按2.1.2 项方法制备供试品溶液，2.2 项色谱条件进行测定，连续进样6 次，记录HPLC 色谱图。以6号峰（罗汉果皂苷Ⅴ）为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD），其中相对保留时间RSD 为0.1%～0.2%，相对峰面积RSD 为1.0%～3.9%，表明该仪器精密度良好。

2.4 重复性试验取罗汉果配方颗粒1.0 g（批号1906013），按2.1.2项方法制备6份供试品溶液，2.2项色谱条件分别进样，记录HPLC色谱图，以6号峰（罗汉果皂苷Ⅴ）为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，其中相对保留时间RSD 为0.1%～0.3%，相对峰面积RSD为1.2%～3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5 稳定性试验取罗汉果配方颗粒1.0 g（批号1906013），按2.1.2 项方法制备供试品溶液，按2.2 项色谱条件分别于制备后的0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h进样，记录HPLC色谱图，以6号峰（罗汉果皂苷Ⅴ）为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，其中相对保留时间RSD 为0.3%～1.0%，相对峰面积RSD 为1.6%～4.7%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.6 特征图谱建立及共有峰的标定分别取罗汉果皂苷Ⅴ、罗汉果对照药材、15 批标准汤剂及4 批罗汉果配方颗粒，按2.1.1、2.1.2 项方法制备对照品、对照药材及供试品溶液，按2.2 项色谱条件进行测定，以6 号峰（罗汉果皂苷Ⅴ）为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。

表1 15批罗汉果标准汤剂及4批颗粒各共有峰的相对保留时间

表2 15批罗汉果标准汤剂及4批颗粒各共有峰的相对峰面积

将15 批罗汉果标准汤剂及4 批配方颗粒的HPLC 图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012 版，以1906013 批为参照图谱，通过多点校正及Mark 峰匹配进行分析，结果显示，罗汉果配方颗粒特征图谱有6 个共有峰，见图1、图2，其中峰6 为罗汉果皂苷Ⅴ。各批次间相似度均大于0.90，相似度良好。15 批标准汤剂、4批配方颗粒与对照指纹图谱的相似度为0.996～1.000，见表3。

图1 15批罗汉果标准汤剂及4批配方颗粒特征图谱

图2 罗汉果配方颗粒特征图谱-对照图谱

表3 15批罗汉果标准汤剂及4批颗粒相似度结果汇总

3 讨论

3.1 特征峰的确认研究过程中，供试品色谱中呈现6个特征峰，选择保留时间适中且为检测指标成分的罗汉果皂苷Ⅴ作为S 峰。计算1～5 号峰与S 峰的相对保留时间，结合15 批汤剂及4 批配方颗粒成品6 个特征峰的相对保留时间范围，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为：0.256（峰1）、0.328（峰2）、0.357（峰3）、0.483（峰4）、0.585（峰5）。

3.2 色谱柱的选择罗汉果中含有皂苷、黄酮、多糖等多种成分［2，11，12］，且极性偏大，采用常规反相C18柱的分离模式，色谱峰较为集中，分离度不好，故建议采用亲水相互作用色谱HILIC 模式进行分离［13］。本研究中选用Agilent Poroshell 120 HILIC-Z （100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色谱柱，为HILIC 两性模式，各色谱峰保留时间适宜，分离度较好。

3.2 检测器的选择研究过程中，尝试使用紫外检测器，结果显示各峰响应较低。后续更改为CAD 检测器，基线平稳、灵敏度高、峰形较好。CAD 是一种新型通用型检测器，其响应不受化合物紫外吸收基团的影响，仅与分析物颗粒的质量有关，广泛应用于各类小分子、大分子化合物，且对大多数化合物的响应一致，具有检测限低、重现性好、稳定性好等优点［14，15］，但由于其本身的设计为电喷雾式检测器，故流动相中不可加入挥发性差的试剂，建议首选乙腈、甲醇、水等溶剂。

综上所述，采用HPLC-CAD 法建立的特征图谱检测方法，可以用于罗汉果配方颗粒的质量控制，为罗汉果配方颗粒的全面质量研究和标准制定提供了技术支撑。