供试品制备方式对气相色谱法测定人血白蛋白辛酸钠含量影响的研究

崔均花，郭心怡，张宝献，滕世超，杨 柳，张 穹

（华兰生物工程重庆有限公司，重庆 408100）

人血白蛋白用于临床已有几十年的历史，其有效性、安全性已通过长期的临床实践得到证明[1]。人血白蛋白注射液系水溶性胶体无菌制剂。其特点是既易溶于水又存在自发性絮凝的趋向，并易受多种理化因素影响而变性，从而失去生理活性[2]。在生产过程中，加入适量的稳定剂，可使蛋白遇热不致变性[3]，而辛酸钠的加入不仅使加热灭活病毒成为可能，同时也提高了贮存期的稳定性[2]。但需要控制其加入的量，如果加入的量不够，会使蛋白受热不稳定，不能起到稳定制品的作用；加入的量过多，则将成为制品的杂质,从而影响制品的纯度[3-4]。辛酸钠含量的常用测定方法为《中华人民共和国药典》2020 年版通则中的“3111辛酸钠测定法”，其中对人血白蛋白辛酸钠含量的测定有质量要求，即每1 g 蛋白质中辛酸钠的含量应为0.14 ～0.18 mmol[5]。该测定法中对1.5 mol/L 高氯酸溶液的加入方式没有作详细规定，通过在长期检测过程中发现，辛酸钠含量测定平行性不理想，容易出现实验室偏差，同时发现辛酸钠含量测定供试品制备中离心后蛋白层存在不同形态。经调查分析发现，蛋白层存在不同形态的原因为加入1.5 mol/L 高氯酸溶液所致。在本文中，笔者主要是分析两种供试品制备方式对气相色谱法测定人血白蛋白辛酸钠含量结果的影响，旨在为提高辛酸钠含量测定的准确性、规范辛酸钠含量测定方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品

人血白蛋白样品为华兰生物工程重庆有限公司产品，批号：201901001，规格：10 g/ 瓶（20%，50 mL）。

1.2 主要试剂与仪器

辛 酸（级 别：GC，批 号：MKCB9218，纯 度≥99%）购自SIGMA ；庚酸（级别：GC，批号：BCBJ6352V，纯度≥99.0%）购自SIGMA；高氯酸（级别：GR，批号：20211130）购自国药集团；三氯甲烷（色谱级，批号：20181113，纯度≥99.5%）购自国药集团；GC-2014 气相色谱仪、LabSolutions 工作站及氢火焰检测器（FID）均购自日本岛津；色谱柱HP-FFAP（0.53 mm×30 m×1.0 μm）购自Agilent。

1.3 供试品制备

取人血白蛋白适量，用纯化水稀释成每升含蛋白质40 ～50 g 的溶液。精密量取0.5 mL 此溶液, 共取12 份。分别加庚酸内标溶液30 μL，其中6 份直接加1.5 mol/L 高氯酸0.2 mL，然后于振荡器上混合1 分钟；另外6 份在振荡器上边混合边加1.5 mol/L 高氯酸溶液0.2 mL。于振荡器上混合1 分钟后，分别加三氯甲烷4 mL，于振荡器上混合2 分钟，以每分钟3000 转离心20 分钟，除去上层水相，小心地将三氯甲烷层倾入10 mL 试管中，即得供试品溶液。

1.4 实验操作

辛酸对照品溶液、庚酸内标溶液、标准曲线处理、色谱条件、系统适用性试验、测定均参照《中华人民共和国药典》2020 年版通则中“3111 辛酸钠测定法”进行，但加入三氯甲烷离心后不进行挥干处理，直接注入1 μL 于气相色谱仪中进行分析。

2 结果

2.1 系统适用性试验

通过实验得出，辛酸峰与庚酸峰的峰面积分离度（R）为7.119 ～7.218，满足大于1.5 的要求，辛酸峰的拖尾因子（T）为0.987 ～1.015，满足0.95 ～1.20的要求。辛酸对照品溶液连续进样5 次，所得辛酸峰与庚酸峰面积之比的相对标准偏差（RSD）为0.05%，满足小于5% 的要求。测定结果见表1。

表1 系统适用性试验结果

2.2 标准曲线的绘制

以各辛酸对照品溶液峰面积与庚酸内标峰面积之比对各辛酸对照品溶液加入量（μL）作直线回归分析，求得直线回归方程。通过实验得出，辛酸钠含量测定标准曲线为Y=0.0573445X-0.0851292，相关系数为0.9999494。满足大于0.99 的要求。实验结果见图1。

图1 辛酸钠含量测定标准曲线

2.3 供试品制备方式不同对辛酸钠含量测定的影响

2.3.1 供试品制备方式 方式一：直接加1.5 mol/L 高氯酸0.2 mL，然后于振荡器上混合1 分钟。供试品离心后的蛋白层如图2 所示。方式二：在振荡器上边混合边加1.5mol/L 高氯酸溶液0.2mL, 于振荡器上混合1 分钟。供试品离心后的蛋白层如图3 所示。

图2 供试品离心后的蛋白层

图3 供试品离心后的蛋白层

由图2、图3 可知，加入1.5mol/L 高氯酸溶液方式的不同对供试品离心后的蛋白层有影响（供试品离心后的蛋白层有明显差异）。图2 的蛋白层不平整，有凝块；图3 的蛋白层平整，无凝块。

2.3.2 测定 按1.4 实验操作中的方法进行辛酸钠含量的测定（两种不同供试品制备方式所得供试品的检测方法保持一致）。将测得的人血白蛋白的辛酸峰与庚酸内标峰的峰面积之比代入已得直线回归方程后，再乘以辛酸对照品溶液浓度，即得人血白蛋白的辛酸绝对量（μg）。按下面公式计算人血白蛋白的辛酸钠含量：辛酸钠含量（mmol/g）=。式中A 为供试品溶液辛酸绝对量（μg）；0.5（mL）为取样量；n 为供试品稀释倍数；c 为供试品蛋白质含量（g/mL）；144.22 为辛酸的分子量（1 mmol 辛酸相当于1 mmol 辛酸钠）。通过表2 可知，供试品制备方式的不同对辛酸钠含量测定结果有明显的影响。供试品处理时直接加入1.5 mol/L 高氯酸溶液后，于振荡器上混合1 分钟这一处理方式所得供试品的辛酸钠含量结果偏小，且超出人血白蛋白辛酸钠含量测定质量的要求范围（每1 g 蛋白质中应含0.14 ～0.18 mmol）；供试品在振荡器上边混合边加入1.5 mol/L 高氯酸溶液，混合1 分钟这一处理方式所得供试品的辛酸钠含量结果稳定，且与理论辛酸钠投料量0.168 mmoL/g较接近。

表2 不同供试品制备方式所得供试品的辛酸钠含量结果

对两组结果进行统计学分析发现，双样本t检验P＜0.05，有显著性差异（对结果的影响较大）。见表3。

表3 t- 检验: 双样本等方差假设

3 结论

通过分析两种供试品制备方式对气相色谱仪测定人血白蛋白辛酸钠含量的影响得出以下结论：供试品加1.5 mol/L 高氯酸溶液沉淀蛋白质时，不同的处理方式对辛酸提取有明显的影响，直接加入1.5 mol/L高氯酸会使供试品溶液中局部高氯酸浓度过高，使蛋白质快速变性沉淀产生凝块，导致部分辛酸包裹在蛋白质沉淀中，影响供试品溶液中辛酸的提取。采用在振荡器上边混合边加入1.5 mol/L 高氯酸沉淀蛋白质的方式，可有效避免供试品溶液中高氯酸局部浓度过高，使蛋白质变性沉淀过程均一，避免凝块，供试品溶液中的辛酸能够完全提取并转移至三氯甲烷中，保证检测结果的准确性。