荧光纳米探针在肝癌早期诊疗的研究进展

熊彦凌，李 菁

1湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410000；2湖南中医药大学第一附属医院肿瘤科，湖南 长沙410007

肝癌（HCC）是我国常见的消化系统恶性肿瘤，多因肝细胞或肝内胆管上皮细胞癌变所致。临床常用手术切除、肝移植、免疫治疗、靶向治疗及放化疗等［1］方法治疗肝癌，但仍存在靶向效果差、毒副效果强、确诊时间晚以及肝癌细胞的耐药性等问题。大量研究表明，纳米技术的发展能够有效解决上述问题［2］。目前，肝癌的早期诊疗主要依赖于MRI、光热成像、荧光成像和光声成像，其中荧光成像具备的高敏感度、良好稳定性、低毒性等优势。荧光纳米探针通过荧光成像技术与一项或多项诊断手段整合在同一种纳米材料上，对肝癌的早期诊疗及一体化具有重要意义。本文将对荧光纳米探针在肝癌早期诊疗中的研究进展加以综述,旨在为未来肝癌的诊疗提供新思路。

1 荧光纳米探针简介

纳米材料是在三维空间中至少有一维处于纳米范围（1～100 nm）或以它们为基本单位构成的材料，具有体积效应、表面效应、量子效应、宏观量子隧道效应等特性，使得纳米材料在生物应用、化学、肿瘤预防与诊疗［3］等领域获得广泛关注。纳米探针作为能检测细胞的新型生物传感器，在肿瘤的诊断中有着独特优势。如纳米探针凭借纳米尺度的大小和较长半衰期，使其容易穿透肿瘤的内皮细胞，并滞留在肿瘤中（高渗透长滞留效应）［4］；通过纳米技术表面修饰与生物结合制成的响应探针可用于实时原位成像［5］；其具有较大的比表面积和大量的活性位点，与特定组织靶向结合，也可以将不同模式的信号分子进行选择性组合，从而达到高通量、多模态成像目的。

纳米材料的光学、可定向合成组装等自身特性能够优化荧光成像。常用的荧光染料标记可将肿瘤组织周围过表达的物质激活发光，肿瘤周围及正常组织中则实现荧光淬灭［6］，但易表现荧光效率低、光稳定差等缺点。而荧光纳米材料会进一步考虑生物相容性、识别、光控、载药等功能需求，对探针进行修饰组装，最终有利于生物成像及医疗诊断。与此同时，靶向荧光纳米材料通过针对肿瘤细胞过表达的生物标志物特异性激活［7］，能够精准定位癌症病灶的边缘，为肝癌早期诊疗提供重要依据。

2 特异性靶向探针

在探针上加载肿瘤靶向配体，给予探针选择性识别肿瘤的能力，能够有效提升成像的对比度。目前认可的肝癌特异性分子靶点包括上皮细胞黏附分子（EpCAM）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC-3）、血管内皮生长因子、CD44、羧酸酯酶［8］和生物素受体等，这些靶向分子在肝癌早期研究中显示出较好的效果。

2.1 靶向GPC-3

GPC-3是一种存在于细胞膜表面的肝癌特异性糖蛋白［9］，在正常人体肝细胞中不表达。它的升高与肝癌的发病和预后有很大关联，是肝癌早期诊断的重要指标。

有学者通过将纳米颗粒偶联多肽片段TJ12P1得到能够靶向肝癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 的纳米探针Ag2S@BSA-TJ12P1。实验通过近红外光成像在体成像观察微小转移灶。结果显示GPC-3在肝癌细胞系中均高表达，有利于早诊断肝癌微小转移病灶［10］。

2.2 靶向生物素受体

生物素作为人体肝脏中含量较多的水溶性维生素B群成员，可与萤光素结合且不会对其生物活性产生干扰，是一种理想的标记物质。

具有荧光激活特性的近红外（NIR）纳米探针在癌症诊断方面具有优势，但鲜有报道同时靶向生物素受体和羧酸酯酶用于HepG2肿瘤双靶向成像的“智能”纳米探针。因此，有学者提出一种近红外荧光探针，研究证实了荧光淬灭纳米颗粒NIR-CBT-NP可以有效靶向过表达生物素受体的HepG2细胞，并通过细胞内羧酸酯酶水解激活荧光，用于肿瘤双靶向成像［11］。

2.3 CD44适配体

CD44是一种跨膜细胞表面糖蛋白，其特征是其变异在人类癌症中显示差异过表达［12］。而适配体是一段以高亲和力与靶分子专一性紧密结合的单链寡核苷酸分子(RNA或DNA)，通过指数富集配体系统进化技术从随机合成的不同寡核苷酸核酸分子库中筛选［13］。

有课题组发现的可结合CD44E和CD44s的适配体（CD44-Apt1），与抑制剂5-FU结合后能有效引导5-FU进入肝癌细胞使药物毒性显著增强数千倍以上且自身无毒［14］。CD44-apt1以CD44表达依赖的方式有效靶向肿瘤移植，表示其具有作为纳米探针提供抗癌治疗的潜力。

2.4 TLS11a适配体

TLS11a适配体是一种可内化到细胞内的人肝癌细胞特异性膜蛋白，通过形成酰胺键与MFS纳米颗粒结合，成为靶向部分。适配体有类似于抗体的识别能力，常被用于以适配体为识别基础的分析技术，如细胞追踪、探针传感技术［15］、电化学细胞传感器［16］等。

有学者提出的纳米探针由带荧光SiO2壳层的Fe3O4核纳米颗粒附着TLS11a适配体组成，大量探针能够被HepG2细胞所摄取，同时研究表明该探针具有稳定的荧光性质将实现肝癌细胞早期诊断实时成像［17］。有研究提出将链霉亲和素偶联荧光二氧化硅纳米颗粒与生物素偶联TLS11a适配体标记的肝癌细胞混合，发现纳米探针对癌细胞具有良好的敏感度［18］。靶细胞存在时，由于对HepG2细胞TLS11a适配体的特异性识别，释放的纳米探针能够引起电化学信号变化。利用适配体传感技术，有学者设计的电化学细胞传感器利用形成的g-四链体/hemin DNAzyme产生电化学响应，利于肝癌细胞的成像和早期诊断［19］。

核酸适配体通过结构识别以高亲和力和特异性靶向细胞表面分子。因此，适配体在靶向肝癌并提高手术疗效方面具有很大潜能［20］。有学者筛选出一种单链DNA寡核苷酸适配体与内源性糖蛋白有高度亲和力，内源性糖蛋白在肝癌细胞和新生血管内皮细胞中均高表达。该探针使得直径1～4 mm的原位肝癌转移病灶到可视化，有望通过术中近红外荧光成像指导肿瘤切除［21］。

2.5 Ep CAM适配体

正常上皮细胞和大多数恶性上皮肿瘤细胞表面表达的Ep CAM可以作为潜在的肝癌干细胞标记物，为循环肿瘤干细胞在肝癌诊断、治疗和预后评价的临床应用提供科学依据［22］。凭借Ep CAM在肝癌内高表达，正常肝细胞内不表达的特性，其有望成为肝癌早期诊疗的新靶点［23］。

有团队开发的靶向成像探针由介孔二氧化硅包覆磁性纳米颗粒合成，然后通过适当的生物偶联途径与Ep CAM适配体和荧光团偶联［24］。该纳米探针通过内吞途径在Ep CAM（包括HepG2）组显示出较强的摄取能力，可用于靶向Ep CAM和荧光成像。

3 荧光成像

作为一项利用光学检测器采集荧光探针发射光从而进行成像的技术［25］，荧光成像技术的应用在肝癌的早期诊疗方面具有重要意义。

为了观察到肝癌细胞的物质变化，有学者设计的纳米探针选取氮掺杂碳点（N-CDs）和金纳米团簇（Au NCs）作为发光纳米材料成功合成了Au NCs/N-CDs纳米颗粒，实现对水样化Cu2+的可视化检测，有望监测体内肝癌细胞内Cu2+的变化，以便尽早发现肝癌［26］。

3.1 近红外荧光成像

荧光成像包括可见光区荧光成像及近红外荧光成像。近年来，近红外荧光成像凭借其组织穿透深、成像速度快、副作用小等优势引起了学者们的兴趣。对比近红外一区（NIR-I）的荧光成像，近红外二区的荧光成像具有更深的组织穿透度、更强的时空分辨率等特征，在肿瘤的成像诊断、造影技术等领域有巨大的应用前景［27，28］。如，靶向纳米探针近红外二区成像实现对肝癌早期微小病的灶精准定位。

3.2 双模态成像

根据不同纳米材料独特的理化性质,纳米探针能对病灶部位进行不同模式的成像,如光学成像、磁共振成像、荧光成像、CT等。而双模态成像可将两种成像模态结合起来从多角度对肝癌进行评估。

结合光学成像的高选择特性和超声成像的强穿透两者优势，光声成像技术成为近几年发展起来的一种新的生物医学影像技术［29］。而荧光成像与光声成像结合更益于帮助患者早期诊断与完整切除。已有研究合成高负载吲哚菁绿的新型荧光纳米探针，其作用为描绘肝癌边缘并在术中区分肿瘤及正常组织。为了在肝癌切除时提供更准确的指导，有研究制备了吲哚菁绿载金核壳纳米颗粒Au@liposome-ICG以整合两种成像策略［30］。事实证明，这种新型的双模态纳米探针对肝癌的早期诊断和治疗具有巨大的潜力。

磁共振具有高敏感度、空间分辨率、高对比度和多参数成像等优势。有学者研发的纳米颗粒Gd-REs@Lips可作为T2加权成像造影剂，增加MRI成像上肝癌组织与周围正常肝组织的信号强度差异；同时可作为近红外二区阴性成像造影剂，增加肝癌精准检测的可能性［31］。开发的近红外二区/MRI双模态纳米探针有望填补肿瘤病变术前成像检测与术中指导之间的空白，并为进一步应对肝癌带来新的机遇。

3.3 多模态成像

多模态成像纳米探针作为以同时结合多种成像技术为原理而设计的纳米探针，为肝癌的早期诊断提供了更加全面而精确的信息，实现在细胞及分子水平对肿瘤进行及时的个性化诊断等［32］。

为了解决单一模态成像带来的局限性，有研究合成一种多模态纳米探针R-GdMFs。该探针利用MRI和NIR成像技术完成了对肝癌小鼠肿瘤的靶向诊断［33］。R-GdMFs随时间在肿瘤部位富集,通过在不同时间点采集MRI图像和荧光图像，发现其具有良好的靶向成像效果，对肝癌小鼠的靶向肿瘤诊断具有潜在的应用价值。

融合多模态成像的探针已广泛应用于肿瘤的诊断及治疗，但鲜有报道多模态诊疗一体化探针应用在微小肝癌领域。有研究合成的ICG-Gd-CuS@BSA-EpCAM纳米探针具有光声、磁共振、荧光三模态成像特性，未来可能用于术前肝癌的排查以及术中引导肿瘤治疗［34］。

4 诊疗一体化

单一的肿瘤治疗常受到三方限制，一是前期不能对肿瘤病灶做到精准定位及诊断；二是对治疗过程中的各项指标变化无法有效监控；三是预后对肿瘤部位治疗效果的监测。因此，诊断与治疗结合更利于肿瘤的治愈。

目前有关肝癌诊疗一体的研究较多，疗法主要包括光动力治疗、光热治疗、栓塞治疗、放射治疗及纳米探针辅助载药等。荧光纳米探针将荧光成像技术与多种疗法联合，为癌症的早期诊疗带来新的可能。

4.1 光动力疗法

光动力治疗指借助光敏剂吸收特定波长光的能量从而产生活性氧（ROS）的治疗手段［35］。这种治疗手段对肿瘤细胞具有强杀伤性且副作用较少，被广泛应用于肿瘤治疗中。

有研究制备的新型纳米探针SPIO/AIE@HA-g-PZLL除具有荧光与磁共振双模态成像外，还具有良好的光动力疗效［36］。研究通过构建的HepG2皮下荷瘤小鼠模型发现在白光照射下摄取纳米粒子后的HepG2细胞生成大量ROS且具有较强的细胞杀伤效果。该探针有望在临床上用于肝癌的双模态成像引导下的光动力治疗。

利用近红外荧光成像技术与光动力疗法实现肝癌的诊疗一体化。有学者构建一种内含光敏剂且外部包覆肝癌细胞膜的荧光纳米探针SSAP-Ce6@CCM，实现了肝癌的诊疗一体［37］。该探针所用的癌细胞膜结构可改善纳米颗粒的稳定性与生物相容性，使得易被同型癌细胞摄取。

4.2 光热疗法

光热疗法通过高光热转换效率的物质注入体内，再经定向识别技术将其集中于肿瘤周围，通过近红外光将光能量转变成热能，从而杀死肿瘤细胞。其中，纳米粒子有助于光热剂靶向肿瘤微环境，实现特定靶向［38］。

有学者使用HCC 特异性多肽SP94、近红外染料Cyanine5.5 对PBNPs 纳米粒子进行修饰，最终合成SP94-PB-SF-Cy5.5［39］。探针实现了索拉菲尼的靶向递送及温控释放，将靶向治疗和光热治疗相结合，有效治疗小鼠局部的肝癌。光热治疗与缓解缺氧两种方式结合可刺激机体产生抗肿瘤免疫，减轻免疫抑制作用。该探针有效缓解肝癌预后差、易复发和转移等问题，开创性地将光热治疗与免疫相联合，对肝癌治疗具有重大贡献。

有学者拟对肝癌发展过程中的关键节点进行光声成像及关键分子功能的在体可视化，合成了具有近红外二区成像及光热性能的肝癌特异性靶向纳米探针Pt@PDA-c，从而精准进行诊断及光热治疗，为肝癌诊疗的应用提供新的思路［40］。

4.3 光热/光动力联合治疗

单一的光治疗往往不能彻底根除肿瘤。光热疗法若发生肿瘤各部位受热不均的情况，肿瘤就不能彻底根除。光动力疗法利用ROS杀死肿瘤细胞，但事实上大多数实体肿瘤的缺氧会严重限制光动力治疗的效率。一些光敏剂的疏水性和肿瘤选择的局限性也会降低光动力疗效。因此，光热/光动力联合治疗利于提高肝癌的疗效及减轻副作用。

为提高荧光纳米探针的疗效，有研究提出了一种表面修饰CD147的金纳米颗粒并负载光敏药物IR820的纳米探针，经体内治疗实验证明其具有良好的光热/光动力治疗效果。该探针的发明对基于纳米材料的肿瘤联合治疗寻找新策略具有重要意义［41］。借助联合治疗思路，有课题组设计了金纳米颗粒与基质金属蛋白酶-2偶联并负载光敏药物IR820用于肝癌光热/光动力联合治疗，具有不错的抗癌能力［42］。

4.4 放射治疗

肿瘤放射治疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法，成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一。肝癌的放射治疗受限于肝脏对放射的耐受性较低，放射增敏剂可以有效降低所需的辐射剂量，而钆的原子序数较高，常作为肿瘤辐射增敏剂［43］。

有研究开发的AGuIX纳米颗粒是一种钆基纳米颗粒，可携带放射性同位素或荧光标记物用于SPECT、PET、荧光成像［44］。研究人员用64Cu标记AGuIX制成放射性示踪剂64Cu-AGuIX，在放射治疗研究中观察到，在提前注射AGuIX的裸鼠移植瘤中发现18F-FDG（癌细胞摄取一种葡萄糖类似物）摄取减少。研究证明，AGuIX可以作为PET成像的治疗性放射敏化剂来指导肝癌的放疗。

4.5 栓塞治疗

栓塞治疗通过动脉或静脉导管将塞剂注射进病变组织的供血血管，阻断病变组织的血液循环，从而达到清除病变组织、控制出血量、治疗肿瘤和血管病变的功能。

肝癌的血供十分丰富且栓塞治疗易损伤正常肝组织，为了提高肝癌的栓塞准确率，既往研究提出靶向栓塞肿瘤血管的方式来精确栓塞肿瘤。以MnCl2、TMA·OH和H2O2为原料制备的MnO2/BPD纳米颗粒能够测量荧光成像等多种成像信号的变化，同样也能够靶向肿瘤新生血管上的低密度脂蛋白受体［45］。在光动力的条件下，该探针能够触发凝血瀑布准确栓塞肿瘤血管，有望应用至肝癌的诊疗一体化。

5 总结与展望

在分子影像学的研究中，荧光纳米探针因其具有高敏感度、低毒性、良好靶向性等特点，已越来越多应用于肝癌早期诊疗领域。纳米探针研究不断深入，但仍存在诸多问题需要探究。纳米荧光材料在生物体内存在潜在的生物毒性；部分纳米材料易富集且难以降解，影响正常细胞代谢；肿瘤靶向特性的纳米药物如何提高疗效和安全性方面等［46］。

随着纳米技术的介入，集靶向运输、成像监测和药物治疗等功能于一体的诊疗一体化纳米体系极大可能成为未来的研究趋势。在制备和应用诊疗一体纳米材料的过程中也存在需要进一步研究的问题。如何设计新型高效安全的多功能诊疗一体化纳米材料，实现对肿瘤的精准定位诊断，以及如何建立诊疗一体化纳米材料评估体系与管理准则等问题亟待解决。除此之外，纳米颗粒与中药的交叉应用［47］、纳米载体与纳米平台构建［48］、纳米药物递送系统研发［49］等纳米技术在未来也具有很大的潜能，为更好地治愈肝癌带来无限的可能。