雷米普利与白藜芦醇联用通过减弱RhoA/ROCK通路改善早期糖尿病肾病大鼠肾小球硬化实验研究

林添辉，崔艳铭，吴传聪，卢勤燕，魏建波，丁韦仁，李业豪，彭翔

广州医科大学附属第六医院（清远市人民医院）风湿免疫科，广东 清远 511500

近30 年来，我国糖尿病（DM）患病率明显增加，患病人数已达1.44 亿，高居全球首位[1-2]，其中约20%～40%的DM 患者合并糖尿病肾病（DKD），现已成为终末期肾病的主要原因之一[3-4]。临床上，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）通过降低血压、选择性扩张出球小动脉，从而降低肾小球内压、改变肾小球的结构进而减少蛋白尿，是治疗DM 患者的首选药物之一[5]。其中，雷米普利是一种广泛使用的口服ACEI，具有较强的ACE 抑制活性和较长的作用时间。研究表明，在实验动物模型中，雷米普利具有缓解DKD 的作用[6-9]。有研究表明，除了高糖血症外，氧化应激是DKD 发病机制的重要因素[10]。中药虎杖含有多种药理活性成分，其主要有效成分白藜芦醇（RES）即3，4，5 一三羟基二苯乙烯。Wang X等[11]的一项研究表明，白藜芦醇通过调节SIRT1/FOXO3a 通路来改善DKD 大鼠肾小管中高血糖引起的氧化应激，从而改善DKD 大鼠的肾小球硬化。同样，Wen D 等[12]的报告显示白藜芦醇通过调节血管生成来减弱DKD。但是，目前雷米普利与白藜芦醇联用治疗DKD 的研究报道较少，其联用治疗效果尚未有明确定论。本研究在不使用降糖药物干预的情况下，评估雷米普利与白藜芦醇在链脲佐菌素（STZ）诱导的早期DKD 大鼠模型中单用或联用的治疗效果，探讨雷米普利与白藜芦醇联用是否可通过抑制RhoA与ROCK 蛋白表达水平，减轻肾脏纤维化。

1 材料与方法

1.1 药物雷米普利（PHR-1446，Sigma Aldrich，St.Louis，Missouri）的CAS 号为87333-19-5，分子式为C23H32N2O5，分子量为416.51。白藜芦醇（R5010，Sigma Aldrich）的CAS 号为501-36-0，分子式为C14H12O3，分子量为228.24。STZ（V900890，Sigma Aldrich）CAS 号18883-66-4，分子式C8H15N3O7，分子量265.22。

1.2 动物实验动物实验方案经广州医科大学实验动物伦理委员会审核批准（No.2018-065）。本研究共使用40 只SD 大鼠（购自南方医科大学实验动物中心），全程饲养于以下标准环境：温度25 ℃、湿度60%，光/暗循环12 h，自由饮水、自由采食普通饲料。对照组大鼠（n=8）于建模第1 天腹腔注射柠檬酸缓冲液（1 mL，pH=3.5）1 次。STZ 诱导糖尿病组大鼠（n=32）于建模第1 天腹腔注射用柠檬酸缓冲溶液（pH=3.5）配制的STZ 溶液，注射剂量为15 mg/kg。建模第2 天，注射STZ 的大鼠空腹血糖水平超过20 mg/dL，即STZ 成功诱导大鼠糖尿病表型，直至第35 天，大鼠出现微量蛋白尿，则表示STZ 诱导早期DKD 大鼠建模完成[13]。第36 天起开始药物干预实验，对照组大鼠连续10 d，每天用1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）灌胃。另将STZ 诱导的早期DKD 大鼠分为4 组（n=8），连续10 d，分别给予1 mL PBS、白藜芦醇（15 mg/kg）、雷米普利（10 mg/kg）、白藜芦醇（15 mg/kg）+雷米普利（10 mg/kg）灌胃，每天1 次。剂量根据课题组以前的工作或其他参考资料选择[7，14]。第45 天，所有大鼠在5%异氟烷麻醉情况下完成心脏采血，处死后采集组织标本进行后续的蛋白质样品制备及分析，病理标本制备及血液学分析。

1.3 血液学分析在动物实验的最后一天采集新鲜的血清，并经由检验科实验室（广东省清远市人民医院）鉴定。分析参数为血清葡萄糖（serum glucose）、血清总蛋白（serum total protein）、血清肌酐（serum Cre）、血清糖化血红蛋白（HbA1c）、血清血管紧张素（serum AngⅡ）。

1.4 病理标本制备及检查分析大鼠肾脏组织浸泡于3.9%福尔马林溶液中，于第3 天更换1 次福尔马林溶液。在福尔马林溶液中保存10 d 后，组织分别在60%、70%、80%、90%和100%的乙醇梯度脱水，接着石蜡包埋后制作成厚度为5 μm 的切片，切片通过二甲苯浸泡脱蜡，然后再通过100%、90%、80%、70%和60%的乙醇梯度再水化。组织切片采用Masson's trichrome 染色，并使用P250 FLASH系统（3DHISTECH，Ltd.，Budapest，Hungary）拍摄获取图像数据，再使用CaseViewer v2.1 版软件（3DHISTECH，Ltd.，Budapest）将图像数据进行分析处理。每个切片的硬化肾小球数和总肾小球数经鉴定后，计算肾小球硬化/肾小球比率。

1.5 蛋白分析将大鼠肾组织加入蛋白提取液（PRO-PREP，iNtRON Biotechnology，Korea）后置于冰上匀浆。接着在4 ℃以14 000 r/min 离心30 min（离心半径10 cm）后收集上清液，以牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL）作为标准对照，使用考马斯亮蓝蛋白试剂（Kenlor Industries，Santa Ana，California）测定蛋白质浓度。接着所有的蛋白样本采用Western Blot 法进行蛋白电泳进行层析分离。经过电泳层析分离后的蛋白再使用湿转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，再使用5%BSA 溶液中孵育60 min 并使用以下一抗进行识别：TGF-β（#3711）、p-p38（#4511）、 p38（#2371）、 p- JNK（#4668）、 JNK（#3708）、p-Smad2（#8828）、GAPDH（#5174）、TGFβ- R（#5544）、 RhoA（#2117）、 ROCK2（#9029）、SirT1（#9475）、p-FoxO3（#9466）和FoxO3（#12829），以上抗体均购自 Cell Signaling Technology 公司（Danvers，Massachusetts）。接着将聚偏二氟乙烯膜清洗后添加辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗，如抗兔IgG（#7074，Cell Signaling Technology）或抗小鼠IgG（#7076，Cell Signaling Technology）孵育30 min 再清洗干净，最后添加化学发光剂后，使用化学发光成像仪las4000（GE Healthcare UK，Ltd.）拍摄目标蛋白的条带图像数据。

1.6 统计学方法采用Sigmaplote v10.0 进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）对多组数据进行统计分析。P值小于0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组病理切片检查比较见图1。各组大鼠肾脏切片使用Masson 染色检视肾小球纤维化（硬化）的情况（图1A）。肾小球纤维化数量与肾小球数量比值（图1B）则显示了STZ 诱导早期DKD 病情的恶化程度。STZ 诱导早期DKD 大鼠的肾小球周围有明显的纤维化特征而且肾小球纤维化数量与肾小球数量比值高于其他各组（P＜0.05）。对照组的大鼠肾小球周围则无纤维化的情况发生。白藜芦醇治疗组大鼠肾小球纤维化的程度有轻微减少。雷米普利和雷米普利-白藜芦醇二药联用治疗组大鼠的大鼠肾小球周围则几乎没有纤维化的情况发生，肾小球纤维化数量与肾小球数量比值也与对照组无显著差异。

图1 大鼠肾脏病理切片Masson 染色

2.2 各组血液检查结果比较见图2。各组血清葡萄糖和血清HbA1c 结果分析表明，STZ 诱导DKD 组的大鼠血糖与HbA1c 均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而白藜芦醇[15 mg/（kg·d）]、雷米普利[10 mg/（kg·d）]的单药治疗组与STZ 诱导DKD 组的血糖与HbA1c 相比则无统计学差异，但是白藜芦醇[15 mg/（kg·d）]和雷米普利[10 mg/（kg·d）]联用治疗组的大鼠血糖和HbA1c 均有下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。而各组的血清总蛋白、肌酐、血管紧张素比较均无统计学差异。

图2 各组血液检查结果比较

2.3 各组蛋白信号通路分析结果比较见图3。STZ诱导早期DKD 大鼠的TGF-β/p-p38/p-JNK/p-Smad2/CTGF 信号通路（图3A）蛋白表达并未明显增加，而TGF-β-R/RhoA/ROCK2 信号通路（图3B）蛋白表达则明显增加。此外，在药物干预组别，包含白藜芦醇治疗组、雷米普利治疗组、雷米普利-白藜芦醇联用治疗组的大鼠肾脏组织样本中的RhoA、ROCK2 的蛋白表达量均有降低，其中雷米普利-白藜芦醇联用治疗组的RhoA、ROCK2 的蛋白水平几乎与对照组相同。此外，白藜芦醇是Sirt-1 蛋白的激动剂，因此本研究额外分析了Sirt-1/p-FOXO3 信号通路（图3C），结果表明仅有白藜芦醇治疗组、雷米普利-白藜芦醇联用治疗组的大鼠肾脏组织样本中Sirt-1、p-FOXO3 表达与对照组相比有明显增加，但是与肾小球纤维化无明显关联。

图3 大鼠肾脏组织蛋白电泳分析结果

3 讨论

通过检测STZ 诱导的糖尿病大鼠的血清葡萄糖和HbA1c 水平，结果提示糖尿病大鼠建模成功。Masson 染色显示肾小球硬化率在各组间有类似的表现。这一发现表明早期DKD 可在出现高血糖（糖尿病确诊）的症状后的短时间内开始出现，不应被认为是一种慢性疾病。

DKD 的主要病理特征是肾小球硬化和肾小管间质纤维化，临床上早期DKD 患者的症状为微量白蛋白尿，血糖的管理和控制是目前的主要治疗策略[15]。临床研究表明，高血糖可诱发早期DKD 出现微量蛋白尿，氧化应激、肾小管上皮-间质转化和细胞外基质积累促进早期DKD 向慢性肾病和肾小管间质纤维化发展[16]。出现微量白蛋白尿则表示肾脏功能已经受损，即使患者能够很好的控制血糖，而此阶段的肾脏损伤能否复原尚无定论。

越来越多的证据表明肾小球的结构发生了改变是早期DKD 的诊断指标，有研究表明，TGF-β1 和p-Smad2/3 水平在DKD 中升高[17]，DKD 中胶原蛋白和纤维连接蛋白的水平也升高。事实上，Masson 染色显示胶原在DKD 早期积聚（图1）。白藜芦醇组CTGF 表达略有升高，在雷米普利-白藜芦醇联合治疗组中降低，提示雷米普利似乎对CTGF 有一定的调节作用（图3）。因此，白藜芦醇和雷米普利的联合治疗可抑制CTGF 的表达来改善CTGF 的纤维化作用。TGF-β 信号通路分析表明，TGF-β 信号通路与早期DKD 密切相关，进一步分析显示RhoA/ROCK 信号通路在DKD 早期显著失调（图3）。

内皮功能障碍是DKD 出现早期症状的主要原因，也可能是DKD 进展的原因之一。RhoA 是一种小GTP 酶蛋白，其直接下游靶标Rho 激酶（ROCK）控制多种信号转导通路。有研究发现某些药物可通过减少活性氧（ROS）来抑制RhoA/ROCK 信号通路，从而显著阻止了高血糖破坏的肾内皮屏障功能，这是由Nrf2 的激活介导的[18]。RhoA/ROCK 和NF-κB 信号通路均在DKD 的发病机制中发挥重要作用。Xie X等[19]的研究表明ROCK 抑制剂法舒地尔治疗可抑制RhoA/ROCK 活化和NF-κB 核转位，并显着降低肾FN、ICAM-1 和TGF-β1 蛋白水平，RhoA/ROCK 通路可能调节NF-κB 上调炎症基因并介导DKD 的发展。Shu A 等[20]研究发现梓醇显著抑制AGEs 受体（RAGE）过表达DKD 小鼠的RAGE/Ras 同源基因家族成员A（RhoA）/ROCK 通路，表明梓醇可通过抑制RAGE/RhoA/ROCK 通路改善内皮功能障碍和炎症，从而延缓DKD 的进展。

ROCK 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，ROCK1 和ROCK2 参与肌动球蛋白细胞的骨架重塑和上皮细胞向间质转化。有报道称ROCK1 是DKD 发病机制中的重要因素，在DKD 动物模型中，抑制ROCK1 的表达，可以减少小鼠的蛋白尿以及延缓DKD 的发展[21-22]。

本课题组前期的研究中也发现高血糖直接诱导紧密连接蛋白的增加，可能激活RhoA/ROCK1 通路，导致微血管内皮细胞功能障碍；抑制RhoA/ROCK 通路，可减弱由高血糖引起的内皮细胞的高张力[23]，而白藜芦醇已被报道用于控制血糖水平和降低患心血管疾病的风险[24]，有趣的是，STZ 诱导的DM（图2），白藜芦醇、雷米普利和雷米普利-白藜芦醇联合治疗组在RhoA/ROCK2 信号通路中出现了类似的变化。

有研究表明，白藜芦醇通过激活SIRT1/FOXO1信号通路上调肾皮质自噬水平参与保护肾脏足细胞，从而阻止蛋白尿生成[25]。白藜芦醇被证明可以通过激活Sirt-1 来增强FOXO3 磷酸化[26]，Sirt-1 也被报道在减轻DM 白蛋白尿中有重要作用[27]。本研究发现在STZ 诱导的DM 大鼠中，Sirt-1 和p-FOXO3水平仅在白藜芦醇和雷米普利-白藜芦醇联合治疗组中升高，在PBS 组及雷米普利治疗组中无变化（图3）。

中药虎杖干预DM 动物模型能降低其DM 的发生率和死亡率，大量研究表明，虎杖中的主要成分白藜芦醇具有扩血管、抗血栓、降血脂及对自由基系统引起的脂质过氧化反应有很强的抑制作用[28]，由此，课题组希望在早期DKD 阶段，给予中药虎杖干预，或许能够尽早控制血糖，抑制DKD 的进展，将中药药理研究成果与临床应用有机地结合起来，不断发现传统药物新的治疗用途，为早期DKD 的治疗寻找有效的中西药结合方法。

综上所述，通过观察白藜芦醇、雷米普利在早期STZ 诱导的短期DM 动物模型中的作用，发现早期DKD 可能由肾皮质病变中的部分肾小球硬化引起，正常的肾小球功能代偿性增强，并引起肾小球高过滤。这一发现表明，DKD 的治疗应在早期开始。早期DKD 肾小球硬化中上调的主要途径可能是RhoA/ROCK 信号通路，而不是TGF-β 信号通路。白藜芦醇和雷米普利治疗可略微减慢DKD 进展，白藜芦醇-雷米普利联合治疗可能通过减弱RhoA/ROCK通路显著减少STZ 诱导的早期DKD 大鼠的肾小球硬化。