复方中草药对运输后肉牛应激蛋白mRNA和蛋白表达水平的影响

隋 明，吴亚楠

（1.四川工商职业技术学院，四川都江堰 611800；2.大庆市新科畜牧技术服务中心，黑龙江大庆 163000）

国内相关研究表明，应激的定义是由加拿大病理专家Selye 在1936 年首次提出的，所谓应激是指牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、狐狸、水貂等多种动物在生长过程中受到外界和内部的各种不同刺激（冷热、运输、噪音等）后，机体所产生的一系列应答反应的总称（王莉梅等，2020）。临床中常见的应激反应有冷热交替、转群、换料、噪音及运输等，其中肉牛在运输过程中出现应激症状较为多见，主要表现为体重、肉品质和免疫力下降，严重者可以导致急性死亡，同时可以引起一系列疾病，又称为“肉牛运输应激综合征”（袁建彬等，2020 ；赵宁2020 ；王碧等，2017）。随着我国肉牛养殖业的发展，养殖数量呈逐年上升趋势，因肉牛运输应激导致其发病、死亡或致残现象普遍存在，运输应激可对肉牛生产造成重大的经济损失，严重影响我国肉牛养殖业的发展（刘杨等，2019 ；王晓娜等，2018）。当动物机体遭受多种应激源刺激时会产生一系列的应激反应，在应激源刺激过程中可以诱导机体产生具有不同生理功能的应激蛋白，尤其是热应激蛋白（heat shock protein，HSP），在调控动物机体内外环境稳定起重要作用（郑文亚等，2019 ；袁建彬，2019）。国内许多研究表明，中草药富含多种生物活性物质，具有提高免疫力、抗氧化、抗应激等作用，被广泛应用（杨冬英等，2016）。本试验在肉牛基础日粮中添加不同水平的复方中草药后，模拟运输应激，研究复方中草药对肉牛应激蛋白mRNA 和蛋白表达水平的影响，进一步为肉牛应激中草药研发及揭示抗应激添加剂的分子机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 当归、黄芪、黄精、山药、女贞子、枸杞子、玉竹等中草药，购自北京同仁堂医药有限公司；血清中HSP 70 ELISA 检测试剂盒，购自北京中控生物科技公司；Hsp 90、HSP 70 蛋白单克隆抗体、FITC 标记山羊抗兔抗体均购自由中国兽医药品监察所；组织RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、蛋白提取试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒，购自TAKARA 公司；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、ECL 化学发光染料、BCA 蛋白定量试剂盒，均购自北京索莱宝生物科技公司；蛋白预染Maker，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 主要仪器 多功能凝胶成像系统、实时荧光定量PCR 仪（iQ5 型），美国Bio-Rad 公司产品；多功能全自动酶标仪，TECAN 公司产品。

1.1.3 试验动物 40 头健康的体重相近的荷斯坦育肥牛由本市规模化养殖场提供。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验采用单因素试验设计（王晓娜等，2018），将40 头健康、体重相近的荷斯坦育肥牛随机分成4 组，每组10 个重复，分别为对照组（1 组）、0.5%（2 组）、1.0%（3 组）、1.5%（4 组）复方中草药添加组，饲喂14 d 后进行运输模拟，运输条件为温度：20℃，相对湿度：50%，运输速度：60 km/h，运输时间 5 h。

1.2.2 血清中HSP 70 含量检测 采集不同试验组肉牛运输前、后的血液，离心分离血清，参照血清中HSP 70 ELISA 检测试剂盒说明书进行测定。

1.2.3 组织中样品的处理 试验结束后每组随意抽取5 头试验肉牛进行屠宰试验，取其肌肉组织，参照组织RNA 提取试剂盒说明书提取组织总RNA，用反转录试剂盒反转为cDNA，-80℃保存备用。

1.2.4 HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 蛋白mRNA 表达量的检测 参考曹中赞等（2019）的方法，根据GenBank 中登录的基因序列，设计牛的看家基因GAPDH 及HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 序列（见表1），由成都郝尔斯生物科技有限公司合成。参照组织RNA 提取试剂盒说明书提取组织总RNA 反转为cDNA，以组织cDNA 为模板进行qRT-PCR反应，同时设立空白对照组，每个组织样品设定3个重复。利用2-ΔΔCt法计算HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 基因的mRNA 表达量。

表1 牛的看家基因的基因序列

1.2.5 HSP 70 和Hsp 90 蛋白Western Blotting表达检测 参照蛋白提取试剂盒说明书提取各试验组肉牛肌肉组织中的蛋白质，用BCA 试剂盒检测总蛋白量后，参照说明书进行SDS-PAGE 凝胶配制电泳和Western Blotting，用GelQuant 软件分析HSP 70 和Hsp 90 目的蛋白和内参蛋白的表达量。

1.2.6 数据统计与分析 试验数据用SPSS 18.0软件进行统计分析，采用Duncan’s 法进行多重因素比较，试验结果用“平均值± 标准差”表示，P＜0.05 表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 对肉牛血清中HSP 70 含量的影响 由表2可知，运输后各组荷斯坦育肥牛血清中HSP 70 含量均高于运输前（P＜0.05），与对照组相比，试验2、3、4 组运输前后的荷斯坦育肥牛血清中HSP 70 含量随浓度增加呈下降趋势，其中试验2 组增加（P＞0.05），试验3、4 组显著减低（P＜0.05），3 个试验组相比差异不显著（P＞0.05）。添加不同水平的复方中药可以降低运输后荷斯坦育肥牛血清中HSP 70 含量。

表2 对肉牛血清中HSP 70 含量的影响

2.2 对模拟运输后荷斯坦育肥牛HSP 27、HSP 70 和Hsp90 蛋白mRNA 表达量的影响 由表3可知，3 个试验组运输后的荷斯坦育肥牛肌肉组织HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 的mRNA 的表达量均低于对照组，其中与对照相比，试验2 组运输后的荷斯坦育肥牛肌肉组织HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 的mRNA 的表达量降低（P＞0.05），试验3、4 组运输后的荷斯坦育肥牛肌肉组织HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 的mRNA 的表达量显著降低（P＜0.05），3 个试验组相比差异不显著（P＞0.05）。说明添加不同水平的复方中药可以降低运输后荷斯坦育肥牛肌肉组织HSP 27、HSP 70 及Hsp 90的mRNA 的表达量。

表3 对模拟运输后荷斯坦育肥牛HSP 27、HSP 70和Hsp 90 蛋白mRNA 表达量的影响

2.3 对模拟运输后肉牛HSP 70 和Hsp 90 蛋白表达量的影响 由图1 和表4 可知，3 个试验组运输后的肉牛肌肉组织HSP 70 和Hsp 90 蛋白表达量均低于对照组，其中与对照组相比，试验2 组运输后的肉牛肌肉组织HSP 70 和Hsp 90 蛋白的表达量降低（P＞0.05），试验3、4 组运输后的肉牛肌肉组织HSP 70 和Hsp 90 蛋白表达量显著降低（P＜0.05），3 个试验组相比差异不显著（P＞0.05）。说明添加不同水平的复方中药可以降低运输后肉牛肌肉组织HSP 70 和Hsp 90 蛋白的表达量。

图1 模拟运输后荷斯坦育肥牛HSP 70 和Hsp 90 蛋白表达量检测结果

表4 对模拟运输后肉牛HSP 70 和Hsp 90 蛋白表达量的影响

3 讨论

肉牛在运输过程中出现应激反应，又称为“肉牛运输应激综合征”，运输应激可以导致体重、肉品质及免疫力下降，严重者可能出现急性死亡，引起一系列疾病，给养殖业造成严重的经济损失（王国艮等，2017）。相关研究表明，当动物因环境因素发生应激时，其机体可以通过调控其生理功能来维持内环境的相对稳定，同时可以激发染色体内的基因转录，合成具有特殊功能的蛋白质，即应激蛋白（heat shock protein，HSPs），动物体内HSPs 的合成可以通过多种途径抑制动物体内其余蛋白质的合成（曹中赞等，2019）。相关研究表明，HSPs 广泛存在于生物界中，该蛋白具有自我保护、自我防御等多种生物学功能，尤其是当外界发生不利因素时，动物体内的HSPs 大量合成，并且可以通过多种途径与其他蛋白质发生结合，从而发挥机体自身保护作用，当外界出现不利因素，动物体内会引发应激反应时，机体内合成的HSPs会对机体细胞开启自我保护模式，HSPs 可以作为应激指征（袁建彬等2019 ；郑文亚等，2019 ；王晓娜等，2018）。因此，HSPs 在调控动物机体应激反应中起重要作用。HSPs 家族中包括HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 等多种应激蛋白，其中HSP 70 蛋白是机体发生应激反应时生成量最多的应激蛋白家族成员之一，尤其是当外界应激源刺激时，其含量急剧升高（曹中赞等，2019 ；袁建彬等，2018 ；王国艮等，2017）。本试验发现，模拟运输应激可以使荷斯坦育肥牛血清HSP 70 含量和肌肉HSP 70 表达量明显增加，荷斯坦育肥牛血清HSP 70 含量和肌肉HSP 70 含量升高可能与荷斯坦育肥牛机体对抗外界运输应激带来的危害有关。

研究表明，应激蛋白Hsp 90 可以与其他蛋白分子一同调节体内相关机能，尤其是在应激反应中，Hsp 90 含量变化与心肌梗死的发生有关（袁建彬等，2019 ；郑文亚等，2019）。本试验模拟运输后肉牛肌肉组织HSP 27、HSP 70 和Hsp 90在mRNA 水平和蛋白表达水平均会增高。可能由于模拟运输应激导致体内HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 含量及表达水平增加，在一定程度上可以缓解运输应激对机体造成的损害，由于应激可导致肉牛自身营养消耗加快，快速合成大量应激蛋白，导致其应激蛋白增高。本试验研究表明，在模拟运输应激前饲喂复方中药抗应激可以有效降低HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 含量，有效缓解自身营养消耗，提高其机体抗应激能力，其作用机理有待进一步研究。因此，在肉牛运输时可以应用抗应激添加剂来减少肉牛运输应激综合征的产生，提高畜体抗应激和保持机体稳态的能力。本试验为抗肉牛应激中草药研发及揭示抗应激添加剂的分子机理奠定了理论基础。