不同抗旱性狗牙根种质的抗旱生理响应差异分析

张一龙， 孙晓梵， 李硕， 李培英， 孙宗玖

（新疆农业大学草业学院，新疆草地资源与生态自治区重点实验室，西部干旱区草地资源与生态教育部重点实验室，乌鲁木齐 830052）

水是人类赖以生存的重要资源，随着气候变化、人口增加及城镇化影响，水资源短缺以及水资源分布不均匀问题日益加剧[1]。已有研究表明，新疆的土壤干旱方式以缓慢干旱为主，其干旱覆盖范围在2005年以后增幅越发明显[2]。在水资源短缺时，草坪绿化水首先被压缩，因而揭示草种抗旱机制及采用育种技术提高草种抗旱性成为亟待解决的问题。

研究表明，干旱胁迫下植物氧自由基产生与清除的平衡被破坏，活性氧大量积累，引发膜脂过氧化和膜磷脂的脱酯化反应启动，使叶绿素超微结构受到损害，甚至解体；光合色素含量下降，光合作用受到抑制，植物生长下降；有毒物质的积累进一步加剧植物代谢紊乱，最终使植物受损，甚至死亡[3]。植物对干旱的响应通常受胁迫程度和持续时间及植物基因型和发育阶段的影响[4]。植物在长期适应不同环境过程中，也形成了不同干旱适应机制。研究表明，不同草种间抗旱性存在差异，且同种草种不同基因型间也呈现出不同的抗旱性[5]。孙明伟等[6]研究发现，强抗旱性与弱抗旱性的羊草（Leymus chinensis）叶片的叶绿素和类胡萝卜素含量在干旱胁迫后均升高，且强抗旱性羊草的叶片光合色素含量敏感指数显著高于弱抗旱性羊草。张娜[7]研究表明，随着干旱胁迫程度的加剧，水分敏感品种‘坝筱3号’叶片的叶绿素含量和光合速率呈递减趋势，而抗旱品种‘蒙燕1号’呈先升后降趋势；2种燕麦（Avena sativa）的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性及可溶性蛋白含量均随着干旱胁迫程度的加剧先降低后升高，其中抗旱品种的增幅更快、更多。

狗牙根（Cynodon dactylon）为禾本科多年生匍匐茎-根茎兼有的草本植物，在全世界广泛分布，因其具有繁殖能力强、适应性广、抗旱性强、坪用性好等优良特性，成为暖季型草坪草种质研究的热点。国内外围绕狗牙根抗旱性开展了大量研究，但主要集中在育成品种的抗旱差异及抗旱机制[8-9]，对一些特殊生态型或新选育材料的研究较少，且对不同抗旱性狗牙根的干旱生理响应差异分析研究略显不足。另外，不同狗牙根在干旱下各指标的响应也存在差异，段敏敏等[10]研究表明，轻度水分胁迫下，敏旱型狗牙根种质的脯氨酸含量显著高于抗旱型；中度水分胁迫下，抗旱型狗牙根种质脯氨酸含量显著高于敏旱型；重度水分胁迫下，2种抗旱性狗牙根种质间差异不明显。Ajtahed等[11]研究表明，敏旱型狗牙根种质较耐旱型狗牙根种质具有更高的过氧化氢酶（catalase，CAT)和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。因此，需进一步探明不同抗旱性狗牙根种质的干旱生理响应机制。

新疆拥有丰富的野生狗牙根种质资源，由于长期生长于干旱环境，形成了丰富的遗传变异。本研究在前期研究[12]基础上，以抗旱性存在显著差异的4种狗牙根种质为研究对象，采用渐进式缓慢干旱法对其进行干旱处理，通过对土壤含水量及狗牙根抗旱相关指标进行测定，探讨不同抗旱性野生狗牙根种质对抗旱的响应差异，明确其抗旱响应机制，筛选出不同干旱胁迫程度下的关键性指标，为狗牙根抗旱机理研究及抗旱狗牙根新品种选育提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以课题组前期研究筛选出的4份新疆狗牙根[12]为试验材料，根据其抗旱性划分为2类，具体信息见表1。

表1 供试材料来源及抗旱性Table 1 Origins and drought resistances of test materials

1.2 试验设计

1.2.1 育苗及扩繁 将各供试狗牙根种质的单株进行扩繁，且以盖度为95%以上的盆栽草为原始繁殖材料，将直径为20 cm、深15 cm的盆栽草平均分成大小、体积基本一致的4等份，统一保留地下部分5 cm，将均分后的草移栽至装有1.2 kg混合土壤（花土∶基质土∶黄沙=2∶2∶1，体积比）的塑料盆（直径8 cm，深15 cm）中，盆中混合土壤的有机质含量15.95 %，碱解氮含量129.58 mg·kg-1，速效磷含量13.59 mg·kg-1，速效钾含量99.75 mg·kg-1。每个材料移栽12盆，正常浇水、施肥、修剪等养护管理60 d，待其盖度达90%以上时进行干旱试验。

1.2.2 干旱处理 于2020年8—9月在新疆农业大学室外试验地采用渐进式缓慢干旱法对供试材料进行干旱胁迫处理，即首先充分灌溉至水从塑料盆底部排水孔流出，待无水再流出时，对所有供试材料进行实时称重，并记录，以此时含水量为土壤饱和含水量，此时记作干旱0 d，此后每3 d于下午6点对供试材料进行称重，计算实时蒸散量；称重后进行补水，每次补充灌溉蒸散量的50%（各材料补水量一致，以失水最多材料为准）。为确保试验不受外界水分干扰，降雨前用塑料布遮盖试验材料。分别于干旱处理第0、第7、第14和第20天采集植株顶端向下第2片叶片，用于测定生理指标，每个指标3次生物学重复。

1.3 测定指标及方法

使用铝盒环刀取土样，迅速称取鲜重（fresh weight，FW），然后烘干称重，计算土壤含水量（soil water content，SWC）；采用饱和称重法[13]测定叶片相对含水量（relative water content，RWC）；采用电导率法[13]测定相对电导率（electrical conductivity，EC）；采用二甲基亚砜法[14]测定光合色素含量（photosynthetic pigment content，PPC）；采用氮蓝四唑光化还原法[15]测定超氧化物歧化酶活性（SOD）；采用愈创木酚法[15]测定过氧化物酶（POD）活性；采用过氧化氢还原法[15]测定过氧化氢酶（CAT）活性;采用硫代巴比妥酸法[15]测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用考马斯亮蓝法[15]测定可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量；采用茚三酮显色法[16]测定脯氨酸（proline content，Pro）含量。

1.4 数据处理

采用Excel 2016软件进行数据预处理，用SPSS 26.0软件中One-way ANOVA进行不同干旱时间及不同基因型间的生理指标的差异显著性分析，采用Origin 2018制图。根据各项指标数据的平均值计算单项指标的抗旱系数，并以此为依据，利用隶属函数法对供试材料的抗旱性进行综合评价；采用灰色关联度分析筛选不同干旱程度下的抗旱鉴定关键指标[17-18]。

以抗旱系数（α）来评价不同材料间的抗旱性，某项指标的抗旱系数的计算公式如下。

为减少不同指标间的差异，参照刘一明等[17]将抗旱系数进行标准化，计算公式如下。

式中，X为某一指标的测定值，Xmin为该测定指标的最小值，Xmax为该测定指标的最大值。

若某一指标与抗旱性呈正相关，则采用公式（2）计算其隶属函数值；若呈负相关，则采用公式（3）进行计算。最后依照公式（4）将各指标的隶属函数值进行累加求其平均值。参照伏兵哲等[18]的方法，以隶属函数值作为参考数列、各指标作为比较数列进行灰色关联度分析。关联系数和关联度的计算公式如下。

式中，Ψi（k）为关联系数，ri为灰色关联度。|x0(k)-xi(k)|表示参考数列与比较数列间的绝对差值，minimink|x0(k)-xi(k)|为二级最小差值，maxi maxk|x0(k)-xi(k)|为二级最大差值。ρ为分辨系数，本试验中取值为0.5[18]。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对土壤含水量的影响

由图1可知，随干旱胁迫时间的延长，土壤含水量显著性降低；在干旱第0、第7、第14、第20天时，土壤含水量平均为39.85%、29.75%、22.88%、11.20%。干旱初始（第0天），土壤含水量为39.74%～40.31%，不同材料间差异不显著；干旱第7天时，C10、C32的土壤含水量较C118、C138显著降低9.28%～10.65%（P＜0.05）；干旱第14天时，C10的土壤含水量显著低于C118、C138；干旱第20天时，C118、C138的土壤含水量显著高于C10、C32。

图1 干旱胁迫下不同狗牙根的土壤含水量和叶片相对含水量Fig.1 Soil water content and relative leaf water content of different bermudagrass under drought stress

2.2 干旱胁迫对狗牙根叶片生理指标的影响

2.2.1 相对含水量 由图1可知，随干旱胁迫时间的延长，供试材料叶片的相对含水量均显著降低。干旱0 d时，C10、C32、C138的叶片相对含水量显著高于C118（P＜0.05）；干旱7 d时，C32叶片相对含水量显著高于C118和C138（P＜0.05）；干旱14 d时，各材料叶片相对含水量为39.43%～53.16%，其中C10显著低于C118、C138；干旱20 d时，各材料叶片相对含水量下降至25.61%～38.77%，其中C118、C138较C10、C32显著提高29.32%～51.38%。

2.2.2 叶片相对电导率和丙二醛含量 由图2可知，随干旱胁迫时间的延长，叶片的相对电导率显著增加。干旱0 d时，不同材料间的相对电导率差异不显著；干旱7 d时，C10、C32的相对电导率显著高于C118、C138。干旱14 d时，C32、C10相对电导率分别为40.87%、38.77%，显著高于C118（27.74%）、C138（26.34%）。干旱20 d时，各材料的相对电导率为52.09%～71.80%，不同材料间差异显著，表现为C32＞C10＞C118＞C138。

图2 干旱胁迫下不同狗牙根叶片相对电导率和丙二醛含量Fig.2 Relative electrical conductivity and malondialdehyde content of different bermudagrass leaves under drought stress

随干旱胁迫时间的延长，狗牙根叶片中丙二醛含量呈上升趋势，于干旱0、7、14、20 d时分别为5.16、5.93、9.78、17.36 μmol·g-1。干旱0 d时，不同材料间丙二醛含量差异不显著；干旱7 d时，C32的丙二醛含量显著高于C10、C118、C138；干旱14 d，各材料的丙二醛含量为7.97～11.85 μmol·g-1，其中C10、C32显著高于C118、C138；干旱20 d时，叶片中丙二醛含量达到峰值，为14.85～21.17 μmol·g-1，其中C10显著高于C118、C138。

2.2.3 光合色素含量 干旱胁迫下，不同狗牙根种质叶片的光合色素含量呈现不同的变化趋势（图3）。随着干旱胁迫程度的加剧，C118的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量呈下降趋势；而C138、C32、C10表现为先增后降的趋势，其中在干旱7 d时达到峰值，说明适度干旱可能有助于一些狗牙根种质叶片光合色素含量的增加。C118在干旱胁迫0～20 d均表现出较高的光合色素含量，其中干旱0 d时，其叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量含量分别为1.80、0.45、0.97、2.73 mg·g-1，较其他种质显著提高25.00%～96.40%。C138的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量高于C32、C10；且其类胡萝卜素含量在干旱14 d后表现为最高，干旱20 d时，其类胡萝卜素含量为0.50 mg·g-1，较其他种质显著提高35.14%～56.25%。

图3 干旱胁迫下不同狗牙根光合色素含量Fig.3 Photosynthetic pigment content of different bermudagrass under drought stress

2.2.4 抗氧化酶活性 4份材料的SOD、CAT、POD活性在干旱胁迫下均表现出相同的变化趋势，即随着干旱胁迫程度的加剧，抗氧化酶活性呈先增后降的趋势，但不同酶达到峰值时间有所不同，SOD活性在干旱胁迫7 d达到峰值，而CAT、POD活性在干旱胁迫14 d达到峰值（图4）。

图4 干旱胁迫下不同狗牙根叶片抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activities of different bermudagrass leaves under drought stress

干旱0 d时，C118的POD活性较其他材料显著提高8.71%～32.49%；干旱14 d时，各材料的POD活性均达最高，为10.05～14.77 U·g-1·min-1，其中C138、C118显著高于C10；干旱20 d时，C138的POD活性显著高于C118、C10。CAT活性的变化趋势与POD类似，于干旱14 d时达到峰值，为13.24～16.68 U·g-1·min-1，其中C138的CAT活性显著高于其他材料。干旱0 d时，不同材料间SOD活性无显著差异；干旱7 d时，各种质SOD活性均达峰值，为373.34～461.81 U·g-1·min-1，较干旱0 d时增加35.39%～76.21%，其中C32显著低于其他材料；干旱20 d时，C118和C138的SOD活性差异不显著，但较C10、C32显著提高20.00%～50.73%。

2.2.5 渗透调节物质含量 随着干旱胁迫的加剧，敏旱材料C10、C32的可溶性蛋白含量呈先增后降趋势，于干旱14 d时达到峰值；而抗旱材料C118、C138则呈一直增加趋势，于干旱20 d时达到峰值（图5）。4份材料的脯氨酸含量均表现出随干旱胁迫的加剧显著上升。其中，干旱0 d时脯氨酸为77.37～107.44 μg·g-1，不同材料间差异不显著；干旱7～20 d，C138、C118的脯氨酸含量均显著高于C10、C32；脯氨酸含量于干旱20 d时达到峰值，为784.73～1 465.88 μg·g-1（图5）。

图5 干旱胁迫下不同狗牙根叶片可溶性蛋白和脯氨酸含量Fig.5 Soluble protein and proline content of different bermudagrass leaves under drought stress

2.3 热图聚类分析

由热图聚类分析（图6）可知，轻度干旱（7 d）时，SOD活性较高，4份材料受损害程度均较轻，叶片的EC和MDA含量均较低。随着干旱胁迫程度的加剧，抗旱、敏旱材料被明显区分开来。层次聚类分析表明，干旱14 d时，抗旱材料表现出更高的CAT、POD活性，表明其清除活性氧的能力更强，因而细胞膜受损程度较小；干旱20 d时，抗旱材料通过大量积累Pro与SP来抵御干旱胁迫，而敏旱材料则表现为SOD、CAT、POD活性显著下降，Pro、SP积累缓慢，导致MDA含量与EC激增，表明植株受损较为严重。

图6 4份狗牙根干旱处理7～20 d时各指标的热图聚类分析Fig.6 Heat map cluster analysis of each index of 4 bermudagrass under drought treatment for 7～20 d

2.4 不同干旱胁迫下关键抗旱指标的筛选

对4份狗牙根在不同干旱胁迫时间的抗旱隶属函数值进行计算（表2），并基于此进行指标抗旱关联度分析（表3），结果与热图聚类分析相一致。干旱7 d时，材料间的抗旱隶属值为0.482 2～0.575 7，不同材料间差异较小；干旱14与20 d时，各材料抗旱隶属值间的差异逐渐增大，其中C138、C118高于C32、C10。

表3 不同干旱时间下各指标与狗牙根抗旱的关联度Table 3 Correlations between various indicators and bermudagrass drought resistance under different drought times

为探究在不同干旱胁迫下各指标对狗牙根抗旱性的影响，以旱胁迫处理下各指标的平均隶属函数值为参考数列X0，将叶片相对含水量、相对电导率、总叶绿素含量、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量的抗旱系数值分别作为比较数列X1、X2、X3、……X12进行灰色关联分析，得出各指标与狗牙根抗旱性的关联度。关联度数值越大，表明该指标对狗牙根抗旱性的影响更显著。由表3可知，干旱7 d时叶片的丙二醛含量、相对电导率、相对含水量对抗旱性影响较大；干旱14 d时，叶片的相对电导率、类胡萝卜素含量、SOD活性于抗旱性的关联度较大；干旱20 d时，叶片的脯氨酸和可溶性蛋白含量及相对含水量对抗旱性影响较大。

3 讨论

3.1 干旱胁迫对狗牙根光合色素的影响

植物体内水分亏缺会直接影响叶绿体结构，进而影响叶绿素含量[19]。在干旱胁迫下，抗性越强的种质叶绿体结构完整度越高，叶绿素含量也越高[20]，与本研究结果一致。在整个干旱期内，抗旱种质的总叶绿素含量均高于敏旱种质，其中C118的总叶绿素含量在干旱胁迫的各个时期均为最高，尤其在干旱0 d时，C118的总叶绿素含量较其他材料高58.72%～96.40%，表明其本身具备较高的总叶绿素含量，有利于在干旱胁迫下维持光合作用，从而表现出较优的抗旱性能。胡杨等[21]研究表明，干旱胁迫降低了细穗柽柳（Tamarix leptostachys）幼苗叶片中叶绿素a的含量，对叶绿素b含量无显著影响。本研究表明，干旱胁迫对狗牙根叶片中叶绿素a、b都会造成显著影响。这可能是由于草本和灌木本身差异及对干旱胁迫的响应机制不同所造成的。另外，类胡萝卜素是植物体内重要的抗氧化物质，在减轻和消除由干旱等逆境引发的活性氧伤害方面发挥着重要作用[22]。本研究发现，不同种质的类胡萝卜素含量对干旱胁迫的响应不同，C118虽然在干旱0 d时有较高的类胡萝卜素含量，但其随着干旱胁迫表现为下降趋势；而其余3份材料则表现为轻度胁迫（7d）时类胡萝卜素含量增加，其中抗旱种质C138的增幅最大（33.93%），干旱胁迫7～20 d时类胡萝卜素含量降低，但C138依然能够维持相对较高的含量（0.50 mg·g-1），这可能是其抗旱性强的原因之一。总之，即使都是抗旱种质，但其抗旱机制仍存在差异，C118表现为在干旱各个时期均有较高的叶绿素含量，而C138则表现为维持较高的类胡萝卜素含量。

3.2 干旱胁迫对狗牙根酶保护系统的影响

SOD、POD、CAT是生物体内清除活性氧的主要保护酶[23]。张然等[24]研究表明，干旱胁迫下11份草地早熟禾（Poa pratensis）的SOD、POD和CAT活性显著升高，但不同材料的增幅存在差异。本研究发现，4份供试狗牙根种质叶片的SOD、POD、CAT活性均随干旱胁迫程度的加剧呈先增后降趋势，说明各种质在干旱下都存在通过提高保护酶活性来抵御逆境、减轻伤害的适应机制，但其活性和对干旱的敏感性因逆境条件和基因型的不同而存在差异，且植物抗氧化的防御会有极限，当胁迫程度超过其极限，便会呈现下降趋势，这与张翠梅等[25]研究结果一致。抗氧化酶之间的相互协同作用能够高效清除植物体内产生的活性氧，减轻植物细胞受到的氧化损伤，从而达到缓解干旱胁迫的作用。SOD被称为植物防御活性氧的“第一道防线”，本研究结果表明，SOD酶活性在干旱7 d时达到峰值，随后呈逐渐下降趋势，表明干旱胁迫时SOD率先发挥作用；CAT和POD活性在干旱胁迫7 d时上升趋势并不明显，在干旱胁迫14 d时显著上升，表明此时CAT、POD参与机体抗旱响应，与SOD共同清除活性氧。赵春程等[26]对多年生黑麦草（Lolium perenne）的抗旱响应研究也得到了类似的结论。另外本研究发现，在干旱胁迫下，抗旱种质的抗氧化酶活性增速更快、增幅更大，因此清除活性氧的能力更强，且其SOD在干旱后期（干旱20 d）也表现出较高的活性，这可能也是其抗旱性强的原因之一。

3.3 干旱胁迫对狗牙根渗透调节物质的影响

渗透调节物质的积累是植物响应干旱胁迫最直接的方式之一，脯氨酸和可溶性蛋白是植物在干旱胁迫下产生的有效渗透物质。脯氨酸与可溶性蛋白的积累可以降低植物细胞内的水势，防止水分外流，延缓干旱胁迫对细胞造成的损伤，同时起到保护细胞内大分子结构的作用[27]。研究表明，植物在正常生长环境下，游离脯氨酸常常会转化为其他物质；而在干旱环境下，游离脯氨酸的转化效率极低，使其快速积累、参与蛋白质组成[28]，因而干旱胁迫下，草坪草叶片中可溶性蛋白含量的显著增加及脯氨酸的大量积累与缓解干旱胁迫有着密不可分的关系[29]，这与本研究结论一致。本研究发现，狗牙根敏旱种质叶片的可溶性蛋白含量在干旱14 d时达到峰值，而抗旱种质的可溶性蛋白含量则一直呈现上升趋势；干旱胁迫下各供试种质的脯氨酸含量都有所增加，但抗旱种质增幅更大，积累更快，从而表现出更好的抗旱性能。

3.4 不同干旱胁迫下影响狗牙根抗旱性的关键指标

植物抵御或忍耐干旱胁迫是非常复杂的生理过程，其对干旱的响应受基因型、干旱程度、干旱持续时间的影响。李江艳等[30]利用灰色关联分析发现不同水分胁迫下，影响鸭茅（Dactylis glomerata）苗期抗旱性的有效指标存在差异，轻度干旱下叶片相对含水量及叶绿素和MDA含量与抗旱性密切相关；而重度干旱下RWC及可溶性蛋白和可溶性糖含量对抗旱性影响较大。田小霞等[31]通过逐步回归分析发现叶片相对含水量、脯氨酸含量等指标对供试材料的抗旱性有显著影响。本研究利用灰色关联分析发现，在早期干旱胁迫（干旱7 d）时叶片的丙二醛含量、相对电导率、相对含水量对狗牙根的抗旱性影响较大；在干旱胁迫中期（干旱14 d），叶片相对电导率、类胡萝卜素含量、SOD活性与抗旱性关联度较大；在干旱胁迫后期（干旱20 d）时，叶片的相对含水量及脯氨酸和可溶性蛋白含量对狗牙根抗旱性影响较大。