干旱胁迫对鲜食葡萄叶片解剖结构的影响

王爽， 侯毅兴， 冯琳骄， 卢倩倩， 周龙

（新疆农业大学园艺学院，乌鲁木齐 830052）

葡萄（VitisviniferaL.）是葡萄科（Vitaeace）葡萄属（VitisL.）的一种木质藤本果树，属于浆果类水果，葡萄果肉营养丰富，果实中含有多种营养物质，是日常生活中较受喜爱的水果之一[1]。新疆是我国葡萄栽培较大的地区，该地区光照充足、热能丰富、空气干燥、降雨量稀少和昼夜温差大等特殊的气候条件[2]，非常适宜葡萄的栽培和生长。作为我国葡萄较大栽培生态区，该地区戈壁和沙漠的面积巨大，占总面积的80.55%，水资源短缺、干旱和极端干旱天气频发成为制约农业发展的最重要因素，因此生产上选择耐干旱、耐高温和耐强光照的葡萄品种进行栽培，对新疆地区葡萄产业的发展至关重要。在干旱胁迫下，植物叶片是应对环境变化较敏感的器官之一，而叶片解剖结构与植物的抗旱性具有明显的相关性[3]。白重炎等[4]对干旱胁迫下核桃的抗旱性进行研究发现，叶片上表皮厚度和栅栏组织占叶片厚度的比例越大其抗旱能力越强。王树森等[5]在研究5种灌木的抗旱性时得出，叶片的表皮细胞、厚度、栅栏组织和海绵组织与植物的抗旱性密切相关。王延秀等[6]在研究3种苹果砧木的叶片解剖结构与抗旱性关系时发现，苹果叶片的栅栏组织细胞越长，排列越紧密，其抗旱能力越强。孙志超等[7]通过研究山核桃叶片解剖结构与抗旱性关系发现，抗旱能力较强的品种叶片特征为具有较大的栅海比和细胞结构紧实度以及较小的细胞结构疏松度。潘学军等[8]在对葡萄叶片进行显微结构观察时发现，叶片栅栏组织/海绵组织越大，葡萄的抗旱能力越强。目前，对葡萄抗旱性评价的研究多从形态结构[9]、活性氧代谢[10]、光合生理[11]、内源激素[12]和果实品质[13]等方面进行探讨，关于叶片组织解剖结构与抗旱性之间的关系研究较少。对干旱环境下叶片解剖结构变化的研究已经成为判断植物抗旱能力的一种简单可靠的方法。因此以新疆近年来主栽鲜食葡萄品种和新引进鲜食葡萄品种为研究对象进行不同程度的干旱胁迫，研究不同品种生长势和叶片结构特征的差异，利用主成分分析法对各鲜食葡萄品种抗旱性的强弱进行综合评价，为干旱地区鲜食葡萄品种的筛选和引种提供一定理论依据和科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为新疆维吾尔自治区昌吉自治州北方园艺场提供。1年生扦插自根苗，基部粗度约8.5～9.5 mm，有4～6个芽眼，供试10个品种的来源、亲本及选育单位见表1。

表1 供试品种的基本信息Table 1 Basic information of the tested varieties

1.2 试验方法

试验在新疆农业大学园艺学院实验地进行。将葡萄幼苗种植于上口直径25 cm、下口直径20 cm、高25 cm的塑料花盆中，盆土为乌鲁木齐市四海花卉苗木农民合作社提供的营养土，每盆精准称量5 kg。干旱胁迫设置4个土壤水分梯度，分别为：正常水分供应(CK)，土壤相对含水量为80%；轻度干旱胁迫(H1)，土壤相对含水量为60%；中度干旱胁迫(H2)，土壤相对含水量为40%；重度干旱胁迫(H3)，土壤相对含水量为20%。每个处理6盆重复，10个品种共240盆。从定植后每天于北京时间9∶00采用称重补水法进行补水，控制土壤水分直至严重干旱胁迫状态下1/3的叶片出现50%黄化干枯甚至脱落，胁迫共持续15 d。搭建简易遮雨棚防止雨水洗淋。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 生长势的测定 于胁迫第15天，采用直接测定法对每个处理1年生新梢从基部数第10片叶进行茎节长度（stem length, SL）、茎节粗度(stem diameter, SD)、叶片长度(leaf length, LL)、叶片宽度(leaf width, LW)、新梢长度(new shoot length, NSL)测定。旱害指数依据赵秀明等[14]的方法进行观测，并计算旱害指数，划分等级标准如下。

0级：葡萄的生长发育与对照无明显差异；1级：葡萄叶片有1/3发生萎蔫；2级：葡萄叶片有2/3发生萎蔫；3级：葡萄叶片全部萎蔫或叶片边缘开始黄化干枯；4级：葡萄叶片黄化较重且有30%叶片干枯；5级：葡萄叶片50%黄化干枯，并发生脱落。

式中，D1为旱害级值，L1为相应旱害级株数，L0为总株数，D0为旱害最高级值。

1.3.2 叶片相对含水量的测定 叶片相对含水量（relative water content of leaf, RWCL）的测定方法采用饱和称重法。于胁迫第0、4、8、12和15天，采集葡萄植株1年生新梢从基部数第4片叶，擦去叶片上的尘土后用感量万分之一的电子天平称初始鲜重（fresh weight,Wf），将叶片放入标记好的信封中带回实验室，将整个叶片放入蒸馏水浸泡8 h后取出，擦干叶片表面多余的水分后称饱和重（saturated weight,Ws），将叶片放入标记好的培养皿中，经烘箱105 ℃杀青30 min，80 ℃下烘干至恒重，称量干重（dry weight,Wd），计算其叶片相对含水量。每个处理重复3次，每个重复1片叶。

1.3.3 叶片组织结构的观测 叶片组织结构采用石蜡切片法进行观测[15]。分别于胁迫第0和15天，选取各鲜食葡萄品种1年生新梢从基部数第5片成熟功能叶的中部0.6 cm×0.6 cm作为样本，避开主叶脉，置于FAA固定液（75%酒精∶甲醛∶冰乙酸=90∶5∶5）中保存。于番红固绿染色后封片，每个样品重复3次，在Nikon显微镜下观察拍照，对各品种的上表皮厚度（thickness of upper epidermis, TUE）、下表皮厚度（thickness of lower epidermis, TLE）、栅栏组织厚度（thickness of palisade tissue, TP）、海绵组织厚度（thickness of spongy tissue, TS）和叶片厚度（leaf thickness, TL）进行测量，测量20次求平均值。并按以下公式计算栅海比（palisade tissue and spongy tissue ratio, P/S）、细胞结构紧密度（cell tightness ratio, CTR）、细胞结构疏松度（spongy ratio, SR）和各指标的抗旱系数（drought coefficient, DC）[16]。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2010整理数据和绘图，用Image J软件进行叶片组织结构的观测，用SPSS 19.0软件对各胁迫处理的指标进行单因素方差分析、主成分分析。主成分分析式中：X1表示上表皮厚度；X2表示栅栏组织厚度；X3表示栅海比；X4表示海绵组织厚度；X5表示下表皮厚度；X6表示叶片厚度；X7表示细胞紧实度；X8表示细胞疏松度；X9表示茎节长度；X10表示茎节粗度；X11表示叶片长度；X12表示叶片宽度；X13表示新梢长度；X14表示相对含水量，F1代表主成分1得分，F2代表主成分2得分，F3代表主成分3得分。

2 结果与分析

2.1 不同鲜食葡萄品种旱害指数与抗旱性的关系

旱害指数可以直观地反映植株抗旱能力大小，同时也是衡量品种间抗旱能力差异的宏观指标之一[17]。不同程度干旱胁迫下10个鲜食葡萄品种的旱害指数如表2所示，随着干旱胁迫程度的增加，各品种均遭受不同程度的旱害。在CK下各品种均生长正常；在轻度干旱胁迫时，‘紫甜无核’‘丝路红玫瑰’‘甜蜜蓝宝石’和‘浪漫红颜’的少部分叶片表现出了暂时萎蔫，旱害指数分别为8.00%、5.67%、3.67%和2.67%，其余鲜食葡萄品种生长发育与对照无差别；中度干旱胁迫下，仅‘黑脆无核’正常生长，其余品种叶片均表现出萎蔫和黄化，其中‘紫甜无核’的黄化和干枯率最高，旱害指数为29.33%，‘丝路红玫瑰’次之，为28.00%；重度干旱胁迫下，10个品种的叶片均表现出不同程度的萎蔫、黄化甚至干枯脱落，其中‘紫甜无核’的新梢顶部叶片干枯脱落，基部的叶片出现50%的黄化干枯，旱害指数达到70.67%，而‘黑脆无核’只部分叶片表现出暂时萎蔫，旱害指数仅为6.67%。10个鲜食葡萄品种的旱害指数由小到大依次为‘黑脆无核’＞‘阳光玫瑰’＞‘深红玫瑰’＞‘火焰无核’＞‘户太8号’＞‘夏黑’＞‘浪漫红颜’＞‘甜蜜蓝宝石’＞‘丝路红玫瑰’＞‘紫甜无核’。

表2 不同干旱胁迫程度下10个鲜食葡萄品种的旱害指数Table 2 Drought damage indices of 10 grape varieties under different levels of drought stress(%)

2.2 不同鲜食葡萄品种叶片相对含水量与抗旱性的关系

叶片相对含水量是评价植物受干旱胁迫程度的重要指标之一[18]。干旱胁迫下10个鲜食葡萄品种叶片相对含水量的变化如表3所示，在整个干旱胁迫处理期间，10个鲜食葡萄品种叶片相对含水量随着干旱胁迫时间的延长均呈现出下降的趋势。在干旱胁迫第0天，所有品种的叶片相对含水量均在83.28%～89.51%，品种间无显著差异。干旱胁迫第4天，只有‘黑脆无核’的叶片相对含水量保持在81%以上，其他均下降至80%以下。在干旱胁迫第15天时，品种间的差异达到最大值，其中只有‘黑脆无核’和‘阳光玫瑰’的叶片相对含水量依旧维持在较高水平，分别为62.60%和60.17%；叶片相对含水量稍低的品种为‘深红玫瑰’‘火焰无核’‘户太8号’和‘夏黑’，叶片相对含水量为47.53%～51.09%；而‘浪漫红颜’‘丝路红玫瑰’‘甜蜜蓝宝石’和‘紫甜无核’的叶片相对含水量均低于43%。与干旱胁迫第0天相比，‘黑脆无核’和‘阳光玫瑰’的降幅较小，分别为24.83%和29.47%；‘紫甜无核’和‘丝路红玫瑰’的降幅较大，分别为56.94%和52.85%。

表3 干旱胁迫下10个鲜食葡萄品种叶片相对含水量的变化Table 3 Changes in the relative water content of leaves of 10 grape varieties under drought stress （%）

2.3 不同鲜食葡萄品种叶片解剖结构与抗旱性的关系

2.3.1 不同葡萄品种叶片解剖结构 处在干旱环境下的植物，可以通过改变叶片的显微结构来适应干旱环境，因此可以将叶片的解剖结构作为评价植物抗旱性的重要途径[19]。葡萄叶片的解剖结构包括上表皮细胞、下表皮细胞、栅栏组织和海绵组织等。由图1可知，正常水分供应下10个鲜食葡萄品种的共同特征为栅栏组织由1层排列整齐且紧密的长柱形细胞组成，细胞间隙较小，海绵组织细胞排列紧凑；在重度干旱胁迫处理15 d后，部分鲜食葡萄品种的栅栏组织细胞短缩且排列松散，形状变得不规律，海绵组织细胞排列不规则且细胞间隙较大。在遭受干旱胁迫后，只有‘黑脆无核’和‘阳光玫瑰’的叶片上表皮细胞、下表皮细胞、栅栏组织比海绵组织和细胞紧实度增大；而干旱胁迫下的‘紫甜无核’和‘丝路红玫瑰’叶片的上表皮细胞、下表皮细胞、栅栏组织比海绵组织和细胞紧实度却减少。

图1 干旱胁迫下10个鲜食葡萄品种叶片解剖结构的变化Fig.1 Changes of leaf anatomical structure of 10 grape varieties under drought stress

2.3.2 不同葡萄品种抗旱系数分析 抗旱系数可以反映植物对干旱的敏感程度，使用抗旱系数鉴定法对果树的抗旱性进行鉴定，具有效果直观和便捷的优点，尤其是该方法与鉴定对象的实际抗旱性相差最小[20]。由表4可以看出，‘黑脆无核’‘阳光玫瑰’和‘深红玫瑰’的叶片上下表皮厚度的抗旱系数均在1.05以上，其中‘黑脆无核’的抗旱系数最大，上下表皮厚度抗旱系数分别达到了1.40和1.28，‘火焰无核’的下表皮厚度抗旱系数最小，仅为0.81；‘黑脆无核’‘阳光玫瑰’和‘深红玫瑰’的叶片栅栏组织与海绵组织之比的抗旱系数均达到1.00以上，‘浪漫红颜’的栅海比的抗旱系数最小，仅有0.76；叶片厚度的抗旱系数‘黑脆无核’最大，达到1.36，‘甜蜜蓝宝石’的抗旱系数最小，为0.85；‘黑脆无核’‘阳光玫瑰’和‘户太8号’的细胞紧实度的抗旱系数均达到1.09以上。根据各品种抗旱系数均值的大小，将13个抗旱相关指标对干旱胁迫的敏感程度进行排序，依次为栅海比＞细胞紧实度＞栅栏组织厚度＞下表皮厚度＞叶片厚度＞茎节粗度=新梢长度＞上表皮厚度=茎节长度＞细胞疏松度＞海绵组织厚度＞叶片宽度＞叶片长度。其中，在干旱胁迫下敏感的指标为栅海比和细胞紧实度，其他叶片解剖结构指标和表型指标的敏感程度次之。根据抗旱系数可知，干旱胁迫下栅海比相较于对照升高的品种为‘黑脆无核’‘阳光玫瑰’和‘深红玫瑰’，干旱胁迫下细胞紧实度相较于对照升高的品种有‘黑脆无核’‘阳光玫瑰’和‘户太8号’，而干旱胁迫下其余鲜食葡萄品种相较于对照均降低。

表4 10个鲜食葡萄抗旱相关性状的抗旱系数Table 4 Drought resistance coefficients of 10 drought resistance-related traits of grapes

2.4 不同干旱胁迫下10个鲜食葡萄品种的综合评价

不同程度干旱胁迫下10个鲜食葡萄品种表现出了不同的抗旱能力，分析表5中各品种抗旱相关指标的主成分累计贡献率可知，在14个指标特征值中前3个因子的特征值＞1，累计贡献率达90.44%，表明这3个主成分可以代表原有14个主成分90.44%的信息，因此可以提取前3个主成分进行10个鲜食葡萄品种抗旱能力的分析。

表5 各成分载荷矩阵Table 5 Load matrix of each component

用14个主成分载荷值（表5）分别除以3个主成分特征值的平方根记为特征向量值，再将特征向量与标准化相乘得到各主成分的表达式(式7～9)。

分别用各主成分得分的平均值乘以其相对应特征值的开方，计算出各项指标的隶属函数值，以3个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比作为权重，得出各品种的综合评价值（D值），D值越大说明该品种的抗旱能力越强。

根据表6的排名可知，10个鲜食葡萄品种抗旱能力的强弱顺序依次为‘黑脆无核’＞‘阳光玫瑰’＞‘深红玫瑰’＞‘火焰无核’＞‘户太8号’＞‘夏黑’＞‘浪漫红颜’＞‘紫甜无核’’＞‘丝路红玫瑰’＞‘甜蜜蓝宝石’，在10个鲜食葡萄品种中，‘甜蜜蓝宝石’的综合得分最低，只有0.14，表明抗旱能力最差；‘黑脆无核’的综合得分最高，达到了0.95，表明其抗旱能力最强。

表6 10个鲜食葡萄品种抗旱性隶属函数值及综合评价值Table 6 Drought resistance membership function values and comprehensive evaluation values of 10 grape varieties

3 讨论

3.1 旱害指数与抗旱性的关系

干旱胁迫会导致植物的生长发育受到抑制，使植物在外部形态上表现出旱害症状，因此可以通过判断其旱害程度来直观地分辨植物的抗旱能力[21]。本研究发现，随着干旱胁迫程度的加深，各鲜食葡萄品种的旱害症状逐渐加重，其旱害指数差别明显。重度干旱胁迫下‘紫甜无核’和‘丝路红玫瑰’的旱害指数最大，表明其抗旱能力较弱，这与王勇等[22]在运用自然干旱法进行6个鲜食葡萄品种抗旱性对比试验中得出的结果基本一致。

3.2 叶片相对含水量与抗旱性的关系

叶片相对含水量是植物体内持水与保水共同作用的结果，可以反映出干旱胁迫下植株对水分的利用状况，与水分代谢联系紧密。通常情况下在干旱胁迫期间，叶片相对含水量下降越小的品种其抗旱能力越强[23]。本研究发现，‘黑脆无核’在重度干旱胁迫下仍可以维持较高的叶片相对含水量，表明其在干旱条件下，叶片水分亏缺最小，可以正常的进行水分代谢，抗旱能力最强，与李敏敏等[24]在对葡萄砧木的抗旱性研究中得出的结果一致。分析认为，植物叶片不能直接吸收固态的无机和有机物质，只能吸收溶解在水中进行运输的养分，水作为细胞的溶剂，在水分亏缺时会导致植物生长受到抑制，当叶片相对含水量较高时，其运输营养物质的能力越强，这可能是叶片相对含水量较高的品种抗旱能力较强的原因之一。

3.3 叶片解剖结构与抗旱性的关系

植物水分散失的主要途径为叶片蒸腾，当面临水分亏缺时，叶片作为应对环境变化较敏感的器官，其解剖结构可以反映植物在干旱环境下的适应能力[25]。一般认为植物的叶片厚度和上下表皮细胞越厚，储水能力越强，水分蒸腾的速率越慢，其抗旱能力就越强。翟晓巧等[26]通过对比干旱胁迫下8种落叶乔木叶片解剖结构发现，叶片厚度与品种间的抗旱能力成正比。本研究发现，干旱胁迫后抗旱能力最强的‘黑脆无核’叶片厚度最大。潘昕等[27]对青藏高原25个灌木品种叶片旱生结构的比较发现，叶片厚度和栅海比最大的‘俄罗斯大果沙棘’的抗旱性最强。本研究表明，干旱胁迫下抗旱能力最弱的‘紫甜无核’上下表皮厚度均减小，推测可能是因为水分的亏缺阻碍了叶片水分代谢，使细胞的生长和分裂受阻，从而限制了叶片的生长，这与薛智德等[28]在5种灌木抗旱性研究中种得出的结论一致。通常认为发达的栅栏组织可以保护叶肉细胞免受强光的灼伤，同时还可以更加有效地利用衍射光维持细胞正常的光合代谢。此外，由于栅栏组织分布在叶片结构的两侧，还可以防止干旱萎蔫状态下的机械损伤，而较为松散的海绵组织，可以避免水分蒸发和耗散，提高植物对水分的利用效率，表现出较强的抗旱能力[29]。因此，海绵组织与栅栏组织分化程度可以直接反映植物生长环境的水分状态，被作为评价葡萄抗旱能力的重要指标之一。陈绍莉等[30]在研究葡萄砧木叶片组织结构与抗旱性关系时也得出，抗旱能力最强的‘河岸九号’栅海比最大。本研究发现，10个鲜食葡萄品种的叶片解剖结构参数指标中，栅海比对干旱胁迫的敏感程度最高，抗旱能力较强的‘黑脆无核’和‘阳光玫瑰’栅海比的抗旱系数均达到1.1以上，且栅栏组织均排列紧密，说明高度发达的栅栏组织是葡萄对干旱环境的适应性调节。