埃索美拉唑诱导宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡作用及机制

范佳杨，蔡鑫，熊蓉，梁宵，梁婷，冯刚，刘康，罗岳西

（川北医学院第二临床学院南充市中心医院 1.妇产科，2.组织工程与干细胞研究所，3.肿瘤生物治疗南充市重点实验室，四川 南充 637000）

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率仅次于乳腺癌，死亡率也位居第二［1］。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020 年全球最新癌症数据，每年有近53万例新确诊宫颈癌患者，中国病例＞13万例，且发病年龄逐渐呈年轻化趋势，严重危害女性健康［2-3］。当前对宫颈癌的治疗通常采用以手术、放疗、化疗或三者联合治疗为主的综合治疗模式，但由于放化疗及药物产生的不良反应和耐药等问题，患者的长期预后并未得到显著改善［4-5］，且由于抗肿瘤药物价格昂贵，对患者家庭造成严重的经济负担。因此，筛选高效、不良反应较低且价格低廉的药物已成为抗肿瘤研究的热点方向。

肿瘤细胞与正常细胞的代谢途径存在很大差异，在恶性增殖过程中，肿瘤细胞的能量代谢途径由三羧酸循环为主转变为糖酵解为主，糖酵解产生大量酸性物质，即Warburg 效应。肿瘤微环境是影响细胞代谢的众多因素之一，也是肿瘤细胞赖以生存的综合内环境，在肿瘤的发生发展中起关键作用［6］。肿瘤细胞特殊的代谢途径通常导致微环境内大量H+积累且无法有效清除［7］，引起肿瘤微环境酸中毒［8］。酸性外环境可为肿瘤的发生发展提供相对适宜的环境，增加肿瘤的侵袭力，促进肿瘤新生血管的形成［9］。由于酸性细胞外环境是几乎所有癌症的共同特征，因此抗酸治疗很可能是一种非常重要和有希望的新的癌症治疗方法。

质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）是常用的上消化道疾病治疗药物，除抑制胃黏膜上皮H+-K+-ATP 泵外，还非特异性抑制其他质子泵，抑制肿瘤细胞内H+外排，从而诱发多种肿瘤细胞凋亡［10-12］。目前已有研究表明，PPI 对肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力具有一定抑制作用［13］。

埃索美拉唑（esomeprazole，ESO）是目前抑制效应最强的PPI质子泵抑制剂，具有肝首过效应低、血浆药物浓度高和血浆清除率低等优点，具有较高的生物利用度。近年来研究发现，ESO 对多种肿瘤细胞有抑制作用，如乳腺癌T41 和TS/A 细胞［14-15］、胶质母细胞瘤LN229 细胞［16］及胃癌AGS 细胞［17］等，然而其对宫颈癌细胞的作用及机制研究较少。本研究旨在探讨ESO对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的作用，并进一步探讨其潜在机制，以期为该药在宫颈癌治疗中的运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和主要仪器

ESO（每支40 mg，批号：K1911131），阿斯利康制药有限公司。胎牛血清、MEM、DMEM 培养基和胰蛋白酶消化液，美国Hyclone 公司；CCK-8 试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司；MatrigelTM，美国BD 公司；Transwell 小室，美国Corning 公司；AnnexinⅤ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；BCA试剂盒，上海碧云天生物技术公司；结晶紫、PI和RIPA裂解液，美国Sigma公司；兔抗大鼠胱天蛋白酶3单克隆抗体，美国NEB公司；兔抗人磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated-PI3K，p-PI3K）、兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和p-Akt 多克隆抗体及小鼠抗人Bcl-2 单克隆抗体，英国Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 抗体和山羊抗兔IgG 抗体，杭州联科生物技术有限公司。

3111 型CO2恒温细胞培养箱、Thermo ST40R离心机和Thermo 1300-A2超净工作台，美国Thermo公司；HH-S4 数显恒温水浴箱，江苏金城国胜实验仪器厂；TS100F 倒置荧光显微镜，日本Nikon 公司；ST-360 酶标仪，上海科华实验系统有限公司；BD FACSCaliburTM流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司；电转仪及转膜系统，美国Bio-Rad公司。

1.2 细胞和细胞培养

人宫颈上皮永生化细胞株H8 细胞和人宫颈癌SiHa 细胞购自中国科学院干细胞库；人宫颈癌HeLa 细胞由川北医学院实验室提供。H8 和SiHa细胞用含10%胎牛血清的MEM 培养基培养，HeLa细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，3 种细胞均放置在5%CO2，37℃恒温细胞培养箱内培养。

1.3 CCK-8检测细胞存活率

取对数生长期的SiHa，HeLa 和H8 细胞，用胰酶消化、重悬，细胞计数后，以每孔4×103细胞分别接种在96孔板中。细胞培养24 h后，用ESO〔0（细胞对照组），60，80 和100 mg·L-1〕分别孵育24，48和72 h，每组设3复孔，放置于培养箱中。各孔分别加入100 μL CCK-8 工作液，37℃孵育1 h，用全自动酶标仪测定波长450 nm 处的吸光度（A450nm）值。细胞存活率（%）=（实验组A450nm-空白组A450nm）/（细胞对照组A450nm-空白组A450nm）×100%。

1.4 划痕实验检测细胞迁移率

选用对数生长期的SiHa 和HeLa 细胞，分别以每孔5×104接种在6 孔板中，待细胞完全贴壁融合后，用无菌枪头垂直于孔底均匀划线，用PBS 轻柔洗去悬浮细胞，用ESO（0，60，80 和100 mg·L-1）分别处理细胞24和48 h，于倒置显微镜下观察划痕愈合情况并拍照。细胞迁移率（%）=（初始划痕宽度-测量时划痕宽度）/初始划痕宽度×100%

1.5 Transwell 实验检测侵袭细胞数

用无血清培养基以4∶1 的比例稀释基质胶，取100 μL稀释后的基质胶铺于Transwell上室。SiHa和HeLa 细胞用无血清培养基调整细胞密度至1×109L-1，取100 μL细胞悬液接种在Transwell上室内，下室加入600 μL含10%血清的培养基，分别加ESO（0，60，80 和100 mg·L-1）置于37℃培养箱内孵育48 h，取出上室并吸出其内的培养基，擦去仍未穿透上室的细胞，浸泡于20%甲醇内固定15～20 min，用0.1%结晶紫染色30 min，PBS 清洗后在显微镜下观察并拍照，使用Image J 软件进行细胞计数。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率

SiHa 和HeLa 细胞同1.5 分组和处理，用胰酶消化后重悬细胞，根据凋亡试剂盒说明书操作，将Annexin Ⅴ-FITC试剂和PI染液各5 μL加入400 μL结合缓冲液中，混匀后避光室温孵育15～20 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western 印迹法检测Bcl-2 和胱天蛋白酶3 蛋白表达水平及Pl3K和Akt蛋白磷酸化水平

SiHa 和HeLa 细胞分组处理同1.5，收集细胞，提取蛋白质，根据BCA 法定量蛋白浓度。各组蛋白样品经SDS-PAGE 凝胶电泳和半干法转膜后，用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗〔稀释倍数：Bcl-2（1∶2000）、胱天蛋白酶3（1∶2000）、Akt（1∶2000）、p-Akt（1∶3000）、PI3K（1∶2000）、p-PI3K（1∶2000）、β 微管蛋白（1∶5000）〕，4℃孵育过夜，加入二抗（1∶2000）室温孵育1 h，漂洗3 次后滴加化学发光液显色，于凝胶成像系统下成像。采用Image J软件对蛋白条带进行积分吸光度（integrated absorbance，IA）值分析，以目标蛋白与内参蛋白条带IA值的比值表示目标蛋白相对表达水平；以磷酸化蛋白与总蛋白条带IA值的比值表示蛋白磷酸化水平。

1.8 统计学分析

实验结果数据用x±s表示，使用SPSS 26.0 和GraphPad Prism8 软件进行统计学分析和绘图。采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ESO对SiHa，HeLa和H8细胞存活率的影响

CCK-8 结果（图1）显示，与细胞对照组相比，ESO 作用于宫颈癌SiHa 和HeLa 细胞48 h 后，ESO 80 和100 mg·L-1组细胞存活率均显著降低（P＜0.01）；72 h 后，ESO 60，80 和100 mg·L-1组细胞存活率显著降低（P＜0.01）（图1A和1B），而不同浓度ESO 作用于正常宫颈细胞H8 24，48 和72 h 后，各给药组细胞存活率无显著差异（图1C）。表明ESO 可抑制SiHa 和HeLa 细胞的增殖，对正常宫颈细胞H8无抑制作用。

Fig.1 Effect of esomeprazole（ESO）on viability of SiHa（A），HeLa（B）and H8（C）cells by CCK-8 assay. SiHa，HeLa and H8 cells were treated with ESO 60，80 and 100 mg·L-1 for 24，48 and 72 h，respectively. Cell viability（%）=（A450 nm of ESO group-A450 nm of blank group）/（A450 nm of cell control group-A450 nm of blank group）×100%.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 ESO对SiHa和HeLa细胞迁移能力的影响

划痕实验结果（图2）显示，与细胞对照组相比，ESO 分别处理SiHa 和HeLa 细胞24 或48 h 后，ESO 60，80 和100 mg·L-1组细胞迁移率均显著下降（P＜0.01），表明ESO 可抑制SiHa 和HeLa 细胞的迁移能力。

Fig.2 Effect of ESO on migration of SiHa（A）and HeLa（B）cells. SiHa and HeLa cells were treated with ESO 60，80 and 100 mg·L-1 for 24 and 48 h. A2 and B2 were the quantitative results of A1 and B1，respectively. Cell migration rate（%）=（0 h scratch area-24 or 48 h scratch area）/0 h scratch area×100%.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 ESO对SiHa和HeLa细胞侵袭能力的影响

Transwell 侵袭实验结果（图3）显示，SiHa 和HeLa 细胞经ESO 处理48 h 后，与细胞对照组相比，ESO 60，80和100 mg·L-1组侵袭细胞数均显著减少（P＜0.05，P＜0.01）。表明ESO 可抑制SiHa 和HeLa细胞侵袭。

Fig.3 Effect of ESO on invasion of SiHa（A）and HeLa（B）cells by transwell assay. SiHa and HeLa cells were treated with ESO 0（cell control），60，80 and 100 mg·L-1 for 48 h.A2 and B2 were the quantitative results of A1 and B1，respectively.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 ESO对SiHa和HeLa细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示（图4），经ESO 处理48 h后，与细胞对照组相比，ESO 60，80和100 mg·L-1组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05，P＜0.01），提示ESO可促进SiHa和HeLa细胞凋亡。

Fig.4 Effect of ESO on apoptosis of SiHa（A）and HeLa（B）cells by flow cytometry. See Fig.3 for the cell treatment. A2 and B2 were the quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.5 ESO 对SiHa 和HeLa 细胞胱天蛋白酶3 和Bcl-2蛋白表达的影响

Western 印迹结果（图5）显示，经ESO 处理48 h后，与细胞对照组相比，ESO 60，80，100 mg·L-1组SiHa和HeLa细胞胱天蛋白酶3表达水平明显上升（P＜0.01），Bcl-2表达水平明显下降（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of ESO on expression levels of caspase 3 and Bcl-2 in SiHa（A）and HeLa（B）cells by Western blotting. See Fig.3 for the cell treatment. A2 and B2 were the quantitative results of A1 and B1，respectively. IA：integrated absorbance.x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 ESO 对SiHa 和HeLa 细胞Pl3K 和Akt 蛋白磷酸化的影响

Western印迹结果（图6）显示，经ESO处理48 h后，与细胞对照组相比，ESO 60，80 和100 mg·L-1组SiHa 和HeLa 细胞Akt 和PI3K 蛋白磷酸化水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of ESO on phosphorylation levels of protein kinase B（Akt）and phosphoinositide 3-kinase（Pl3K）in SiHa（A）and HeLa（B）cells by Western blotting.See Fig.3 for the cell treatment. A2 and B2 were the quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

3 讨论

本研究结果显示，正常宫颈细胞H8 细胞在长时间和高剂量ESO 作用下，细胞存活率并不随着药物浓度的升高而呈现明显下降，表明ESO对正常宫颈细胞无明显毒性作用。而经ESO 处理后，宫颈癌SiHa 和HeLa 细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到明显抑制，细胞凋亡率增加，PI3K/Akt 信号通路受到抑制。

细胞凋亡失衡是导致肿瘤无限增殖的重要因素之一，故调控细胞凋亡途径是抗肿瘤的重要策略［18］。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，通常存在线粒体［19-20］、内质网［21］和死亡受体［22］3 条通路。Bcl-2 蛋白家族在细胞线粒体凋亡中发挥着重要作用［23］。胱天蛋白酶家族是存在于细胞质中具有高度同源性的蛋白酶，其中胱天蛋白酶3 是细胞凋亡途径上的终末剪切酶，是细胞发生凋亡的标志性蛋白［24］，同时也是Bcl-2 的下游蛋白。胱天蛋白酶3在内源性通路中的激活可以调控细胞凋亡的启动与执行［25］。本研究结果显示，经ESO 处理后，Bcl-2蛋白表达水平明显降低，胱天蛋白酶3 表达水平明显增加，表明ESO可能通过降低Bcl-2和增加胱天蛋白酶3的表达促进宫颈癌SiHa和HeLa细胞凋亡。

肿瘤的发生发展是由多种信号通路共同作用的复杂过程，其中PI3K/Akt 信号通路是人类癌症中最常被激活的信号通路之一［26］。既往研究表明，PI3K/Akt 信号通路能影响肿瘤细胞侵袭、迁移能力，在调控细胞的增殖和代谢等方面发挥着重要作用［27］。PI3K是存在于细胞质的一种脂类激酶，可被多种细胞外信号激活。Akt 是PI3K 的下游蛋白之一，参与细胞增殖、迁移、侵袭等多种生物过程［28］。Akt在多种肿瘤细胞中被异常激活，参与肿瘤的发生与发展［27］。Chen等［29］研究表明，胃癌细胞SGC7901经质子泵抑制剂预处理后，PI3K/Akt 信号通路被抑制。本研究结果显示，宫颈癌SiHa 和HeLa 细胞经ESO 处理后，PI3K 和Akt 磷酸化受到抑制，表明ESO 可能通过抑制PI3K/Akt 通路，从而诱导细胞凋亡。

综上所述，ESO可抑制人宫颈癌SiHa和HeLa细胞的增殖、迁移和侵袭，同时诱导细胞凋亡，该作用可能与抑制PI3K/Akt 信号通路有关。但本研究仅在细胞水平进行了探讨，存在局限性，后续还需在体内实验中进行进一步验证，为ESO 用于临床治疗宫颈癌提供新思路。