小反刍兽疫病毒感染性cDNA克隆的构建与病毒拯救

王 煜,高月异,高金源,刘伟洁,徐慧琳,薛青红*

(1.中国兽医药品监察所,北京 100089;2.青岛易邦生物工程有限公司,青岛 266041)

小反刍兽疫(peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)引起山羊、绵羊等小反刍兽的一种急性、热性、接触性传染病[1],是世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)法定报告的动物传染病,我国规定为Ⅰ类动物疫病[2]。PPRV是单股负链不分节段的有囊膜RNA病毒,绝大多数PPRV的核苷酸总数为15 948 nt[3],病毒基因组从3′至5′依次分布着N-P-M-F-H-L 6个基因,共编码6种结构蛋白,即核衣壳蛋白(nucleoprotein, N)、磷蛋白(phosphoprotein, P)、基质蛋白(matrixprotein, M)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝素蛋白(hemagglutinin protein, H)、大蛋白(large protein, L),此外PPRV P基因有两个重叠的开放性阅读框,可编码病毒结构蛋白P和非结构蛋白C、V[4-6],病毒最小感染单位是核衣壳包裹缠绕的病毒基因(RNP)复合物。据联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)推测,全球约有62.5%的小反刍动物受到小反刍兽疫的威胁,特别是非洲、亚洲和中东地区[7-8]。2007年7月我国西藏地区首次发生疫情,2013年11月我国新疆地区再次发生,随后疫情遍布全国大多数省份[9-12]。据FAO推测,全球每年因PPR导致的经济损失高达约30亿美元,目前主要采用疫苗免疫接种对PPR进行预防,2015年OIE、FAO联合启动了《全球小反刍兽疫控制与根除策略》,提出了到2030年在全球消灭PPR的目标[13-15]。

作为影响养羊业的重要病原,研究其致病机制为临床疫情的控制提供依据显得尤为重要,而反向遗传操作技术是研究PPRV基因组结构与功能、分子致病机制以及PPRV与宿主相互作用的一个重要工具。因此,本研究旨在构建本实验室保存的PPRV Clone9株感染性克隆,以期为深入研究该毒株的基因组结构与功能、分子致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株来源

Vero细胞由中国兽医药品监察所保存。BHK-T7细胞由中国农业大学刘维全教授惠赠。

PPRV Clone9 株:由 Nigeria 75/1 株(GenBank 登录号:X74443)经 Vero 细胞传代噬斑纯化挑取单克隆获得,由中国兽医药品监察所保存。

1.2 主要试剂

DNA/RNA提取试剂盒、载体pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、Trans 2K DNA Plus Marker、Trans15K DNA Marker均购于全式金生物技术有限公司;Premix TaqTM、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase、PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer均购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒Wizard@Plus Midipreps DNA Purification System、琼脂糖凝胶快速回收试剂盒Wizard® SV Gel and PCR Clean-UP System、转染试剂 FuGENE® 6 Transfection Reagent均购于Promega公司;所有限制性内切酶、高保真DNA组装预混液 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix 购自NEB公司;其他试剂或化学药品均购自Invitrogen或Sigma公司;异硫氰酸荧光素(FITC)-羊抗小鼠IgG购自中杉金桥生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PPRV Clone9株基因组分段扩增 基于PPRV Clone9株的全基因组序列,将其基因组分为6个片段,分别设计RT-PCR扩增引物(表1)。取200 μL PPRV Clone9株F2代病毒液,用DNA/RNA提取试剂盒提取病毒RNA,将提取的病毒基因组RNA进行反转录,生成PPRV-cDNA,然后用设计的引物进行PCR扩增[15]。

表1 PPRV Clone9株分段克隆引物Table 1 PPRV Clone9 strain segmented cloning primer

1.3.2 全长cDNA克隆构建策略 在低拷贝质粒pBluScript II SK(+)中插入T7启动子、终止子和丁肝核酶序列,将PPRV Clone9株全长分为6个片段,利用PCR技术,在扩增片段FL1的上游引物中引入T7启动子序列及与载体酶切位点BssHII左侧同源的15 bp碱基序列,在扩增片段FL2的下游引入与载体酶切位点SnaBI,在FL5片段的3′末端引入丁肝核酶序列及T7终止子。利用PCR方法将PPRV Clone9株基因组8 424位核苷酸G突变为T引入一个点突变,作为拯救病毒的遗传标记。RT-PCR扩增各片段后分别连接至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit,构建中间质粒,测序无误后通过同源重组分两步连入全长质粒载体PB-BSM,构建全长cDNA质粒。

利用同源重组技术,将病毒基因组全长cDNA各中长片段(FL1-FL5)分两步连入载体pBluScript II SK(+),具体如图1所示。

图1 pB-PPRV构建示意图Fig.1 Schematic representation of pB-PPRV

1.3.2.1 载体pB-PPRV-1 (1-7061)的构建:用内切酶BssHII,SnaBI对载体pBluScript II SK(+)进行双切,使载体线性化。利用同源重组酶将片段FL1、FL2、连入双酶切载体pBluScript II SK(+),连接产物转化E.coliHST08感受态,37 ℃过夜培养后挑选菌落进行PCR鉴定,将菌落PCR鉴定为阳性的克隆,送公司测序。

1.3.2.2 载体pB-PPRV的构建:用内切酶SnaBI,MIuI对载体pB-PPRV-1进行双酶切,使载体线性化,PCR 扩增片段FL3、FL4、FL5-1、 FL5-2利用同源重组酶将各片段连入双酶切载体pB-PPRV-1,连接产物转化E.coliHST08 感受态,37 ℃过夜培养后挑选菌落进行PCR鉴定,将菌落PCR鉴定为阳性的克隆,送北京六合华大科技股份有限公司测序。形成载体pB-PPRV。最后对构建好的阳性克隆进行全基因组测序以确保序列的准确性。

1.3.3 PPRV Clone9株各辅助质粒的构建 副黏病毒科各病毒反向遗传学操作平台的建立,除了病毒基因组全长cDNA,还需要提供N、P、L 3个功能蛋白(图2)。蛋白N、P、L基因的克隆由构建成功的含病毒基因组全长cDNA的质粒pB-PPRV为模板设计相应引物扩增而来,扩增引物见表2。

图2 蛋白N、P、L表达载体构建示意图Fig.2 Schematic representation of plasmids for expressing proteins N,P,L

表2 N、P、L基因扩增引物Table 2 Primers used in cloning of genes of N, P, L

利用同源重组技术,蛋白N、P、L基因由SacII和MIuI双酶切连入载体PEMC,分别命名为PEMC-PPRV-N、PEMC-PPRV-P、PEMC-PPRV-L。

1.3.4 病毒拯救及鉴定 将病毒基因组全长cDNA克隆载体pB-PPRV和功能蛋白载体PEMC-PPRV-N、PEMC-PPRV-P、PEMC-PPRV-L共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-T7细胞(表3)。转染2 d后,将每个六孔板的细胞转入2个25 cm细胞瓶继续培养,培养到第4天将细胞瓶冻融,冻融物作为拯救病毒F1代,按10%体积比接入Vero细胞,进行拯救病毒的传代。用间接免疫荧光、Western blot、RT-PCR和序列测定对拯救病毒F3代进行鉴定[15]。

表3 转染液的配制Table 3 Components and amounts of transfection medium

1.3.5 体外增殖动态 亲本毒和拯救的病毒以MOI=0.01剂量接种生长于96孔板中的单层Vero细胞,感染后不同时间点(12、24、36、48、60、72、84、96 h)收取病毒液,并计算相应时间点病毒滴度,绘制病毒生长曲线。

1.3.6 遗传稳定性鉴定 为评价拯救病毒的遗传稳定性,取拯救病毒F0代于Vero细胞上连续传代10次,收获F3、F5、F10代病毒细胞培养物,分别进行遗传标记鉴定、Western blot的鉴定。

2 结 果

2.1 PPRV Clone9株基因组中长片段的扩增及全长和辅助质粒的构建与鉴定

通过PCR对PPRV-cDNA进行扩增,用0.8%琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测,扩增出的片段大小与预期相符(图3A)。全长质粒pB-PPRV经酶切后,应出现两条带,大小分别为5 321和13 689 bp。酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析,出现结果与预期一致,表明全长质粒pB-PPRV构建成功(图3B)。构建成功的辅助质粒pEMC-PPRV-N、pEMC-PPRV-P、pEMC-PPRV-L,经酶切后,酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析,出现结果与预期一致,表明各重组质粒构建正确(图3C)。

2.2 拯救病毒的鉴定

将感染拯救病毒F3代的细胞用抗PPRV-N的特异性单抗进行间接免疫荧光染色。结果表明,拯救病毒感染细胞呈现特异性荧光染色(图4A);将亲本毒PPRV Clone9株及拯救病毒F3裂解物进行Western blot试验,用抗PPRV-N的特异性单抗可检测到目的蛋白条带 (图4B);将F3代拯救病毒培养上清进行RT-PCR及测序鉴定,确定了遗传标记的存在(图4C);拯救病毒体外增殖特性鉴定结果表明,拯救病毒表现出与亲本毒相似的生长特性,且最高生长滴度均可接近106TCID50·mL-1(图4D)。

A．间接免疫荧光鉴定拯救病毒rPPRV Clone9:a.Vero 细胞; b.感染PPRV Clone9的Vero细胞; c.感染rPPRV Clone9的Vero细胞;B．Western blot鉴定拯救病毒;C．拯救病毒遗传标记的序列测定,箭头所指为突变位点;D．拯救病毒感染Vero 细胞的生长动力学曲线A．Indirect immunofluorescence analysis of rPPRV Clone9: a. Vero cells; b. Vero cells infected by PPRV Clone9; c. Vero cells infected by rPPRV Clone9; B．Western blot analysis of rescued virus; C．Sequence determination of rescue virus genetic markers. Arrows indicate the change site;D．Rescue the growth kinetics curve of virus-infected Vero cells图4 拯救病毒的鉴定Fig.4 Rescue virus identification

2.3 拯救病毒传代稳定性鉴定

经基因测序和Western blot结果表明,遗传标记能稳定地存在于拯救病毒基因组中(图5A);各代次病毒稳定表达N蛋白(图5B)。

A．不同代次拯救病毒遗传标记鉴定;B．Western blot鉴定不同代次拯救病毒A．Identification of genetic markers for rescue viruses of different generations;B．Western blot identifies rescue viruses of different generations图5 拯救病毒传代稳定性鉴定Fig.5 Rescue virus passage stability identification

3 讨 论

就目前麻疹病毒属各病毒而言,反向遗传学的研究相对不平衡。麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、犬瘟热病毒(CDV)的研究较多[16-19],其操作系统也相对比较完善。PPRV虽有反向遗传系统的报道,但应用到实际并不多。对于PPRV而言,基础研究相对薄弱,建立科学、有效的反向遗传系统势在必行[20]。

目前,已有报道成功拯救PPRV感染性克隆的方法共有3种,分别如下:胡倩倩[21]利用细胞中的RNA聚合酶II在CMV启动子下,转染Vero Dog SLAMtag(VDS)细胞后拯救PPRV,通过CPE病变,间接免疫荧光以及PCR等方法鉴定成功获得了感染性病毒,该体系虽然采用高效的CMV转录系统,但拯救效率依然很低,每106个细胞只能产生约1～10个病毒粒子,这主要是因为PPRV在感染细胞后,病毒粒子在细胞质中进行组装和复制,而RNA聚合酶II存在于细胞核内,利用细胞中的RNA聚合酶II拯救病毒时,当RNA聚合酶II在细胞核内转录编码病毒基因组时,核膜阻碍转录物输出至细胞质,从而可能影响病毒拯救效率[22]。

Muniraju等[23]采用T7 RNA聚合酶的体系,将病毒基因组全长质粒和3个辅助质粒(N、P、L)附加可以表达T7 RNA聚合酶的质粒一起共转染VDS细胞后,进行病毒拯救。该体系采用五质粒共转染进行病毒拯救,有研究表明,副黏病毒拯救过程中,共转染质粒越多,病毒拯救效率越低[24-25]。

体外拯救负链RNA病毒时,在MV[10]、新城疫病毒(NDV)[26]、水泡性口炎病毒(VSV)[27]等病毒的拯救中,采用T7 RNA聚合酶体系,需要使用表达T7 RNA聚合酶的痘病毒作为辅助病毒,MV等病毒复制速度快,可在辅助病毒对细胞产生损害之前已完成包装、复制和释放;而PPRV需要更长的复制和释放时间,所以痘病毒-T7系统不适于PPRV拯救。稳定表达T7 RNA聚合酶的工程化细胞避免了痘病毒对宿主细胞的破坏,影响复制较慢的病毒拯救。Liu等[28]同样采取T7 RNA聚合酶体系的四质粒系统,转染BSR-T7/5细胞进行PPRV的拯救。

与此同时,国内研究学者翟军军[29]、刘振东[30]和李菊[31]也纷纷构建了PPRV全长基因组的克隆以及拯救病毒必要的辅助质粒,但一直未能拯救成功。

参考报道成功拯救出PPRV的体系,以及借鉴麻疹病毒属其他已成功拯救出的病毒体系,本研究将病毒基因组全长质粒和3个辅助质粒(N、P、L)共转染稳定高效表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞,这样既避免了引入痘病毒对宿主细胞的破坏,同时四质粒转染提高了病毒拯救效率。

4 结 论

本研究使用稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞进行病毒拯救,建立了PPRV Clone9株的反向遗传系统。利用反向遗传系统获得的PPRV Clone9株可用于基础理论的研究和新型疫苗的研发。此外对同种属其他副黏病毒进行类似基因操作提供技术参考。