妊娠期女性牙龈卟啉单胞菌感染对不良妊娠结局的影响

龙黎南,储莉鸣,丁晓颖,张治萍,胡逸凡,王 珣,谢震宇

(上海市浦东新区妇幼保健院1.妇产科;2.医教科;3.院办,上海 201206)

妊娠期妇女由于体内激素水平变化,口腔微生态菌群失衡,加之孕期生活习惯改变和疏于口腔卫生维护,易发展为妊娠期牙周病。据统计,全球范围内妊娠期牙周病的患病率为30%～100%[1]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一种革兰阴性厌氧菌,是牙周病的关键致病菌[2]。研究表明,P.gingivalis不仅与牙周病密切相关,而且能够黏附、侵入上皮细胞,激活细胞内信号转导通路、诱导绒毛外滋养层细胞凋亡[3-5]或分泌毒性产物,或随血液循环播散至全身,与不良妊娠结局(adverse pregnancy outcomes,APO)关系密切[6-8]。但目前研究主要集中于牙周病与不良妊娠结局[9-10],对于P.gingivalis的研究主要在体外细胞学和动物学实验[3,11-12],临床上关于妊娠期P.gingivalis的感染状况及其与不良妊娠结局的前瞻性研究目前尚未见到。基于此,本研究通过检测孕早期孕妇唾液中的P.gingivalis以了解孕妇P.gingivalis的感染状况,探讨妊娠期P.gingivalis感染的影响因素,并从孕早期建立队列,通过前瞻性队列研究分析P.gingivalis感染对不良妊娠结局的影响,为提高妊娠期口腔健康、制定孕期口腔保健服务策略提供科学依据,从而做到早期干预,预防不良妊娠结局的发生,改善妊娠结局。

1研究对象与方法

1.1研究对象

选取2021年12月至2022年2月在上海市浦东新区妇幼保健院初诊的孕早期孕妇为研究对象。纳入标准:①孕周<14周;②在本院定期产检、分娩;③依从性好;④无认知功能障碍和精神障碍者。排除标准:①严重肝、肾、心等器官功能不全;②存在泌尿系统感染;③资料不全,妊娠结局失访;④妊娠结局为自然流产者。本研究通过上海市浦东新区妇幼保健院医学伦理学委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书。

1.2基本资料收集

收集所有研究对象的基本信息,包括年龄、户籍、教育程度、疾病史、不良孕产史、吸烟、孕产次、受孕方式、孕前体质指数(body mass index,BMI)、半年内牙周治疗等情况。

根据国际妇产科联盟对高龄的定义及孕产妇风险预警评估分类,将不同年龄分层为:<35岁、35～<40岁、≥40岁。疾病史:妊娠前患有糖尿病、高血压、自身免疫性疾病其中一种,定义为既往有疾病史。不良孕产史:该孕妇既往妊娠时至少包括早产、低出生体重、死胎、死产、出生缺陷其中一种出生结局,即定义为不良孕产史。孕前BMI=孕前体重(kg)/身高(m)2,根据中国成人超重和肥胖预防控制指南(2020年),按不同BMI分层为BMI<24kg/m2、超重(24.0kg/m2≤BMI<28kg/m2)、肥胖(BMI≥28kg/m2)。吸烟:根据目前状态分为:吸烟、曾经吸烟(现在已经戒烟≥6个月)、从未吸烟。

1.3唾液P.gingivalis 荧光定量PCR检测

1.3.1试剂、材料

唾液采集器购自深圳华晨阳科技有限公司,唾液基因组DNA提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司,SYBR Green PCR试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,P.gingivalis菌株(ATCC33277)由河南科技大学肿瘤研究所惠赠。

1.3.2孕妇唾液样本采集、DNA提取

在采集唾液样本前30min,孕妇用清水将口腔内杂物洗漱干净,期间不能进食或饮用饮料,向采集漏斗中轻轻吐入唾液,直至液体唾液达2mL,将保存液缓缓倒入采集漏斗内,上下颠倒充分混匀。按照唾液基因组DNA提取试剂盒说明书提取唾液样本DNA,-80℃下冻存。

1.3.3P.gingivalis实时PCR

根据P.gingivalis16S rDNA基因序列(GeneBank:NR_040838),使用Primer Premier 5软件设计特异性引物,序列为:forward:5′-AATAACGGGCGATACGA-3′;reverse:5′-TGTTCCTCCGCTTGTGC-3′。PCR反应体系为20μL:SYBR Green Mix 10μL,上下游引物各0.5μL,DNA模板2μL;反应条件:95℃ 5min,95℃ 10 s,60℃ 30s,40个循环,所有反应在ABI-7300型实时PCR(real time PCR)仪上进行,利用ABI Prism 7300 SDS software软件分析扩增结果。每次反应均设P.gingivalis阳性对照、唾液链球菌(S.salivarius)阴性对照及空白对照。

1.4孕期随访、观察不良妊娠结局指标

根据P.gingivalis感染状况将研究对象分为感染组、对照组。两组间户籍、孕次、产次、BMI、受孕方式差异均无统计学意义(P>0.05)。①随访孕期产检情况:产检次数、孕期增重、B族链球菌(group B Streptococcus,GBS);②观察两组的孕产妇合并症、并发症:妊娠期高血压、子痫前期、妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)、早产、胎膜早破、胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)、低出生体重、产后出血、新生儿感染,诊断标准依据人民卫生出版社《妇产科学》第9版[13]。

1.5统计学方法

2结果

2.1基本情况

本研究共纳入390例孕妇,年龄18～45岁,平均年龄(33.26±3.49)岁,其中<35岁201例(51.54%),35～<40岁148例(37.95%),≥40岁41例(10.51%);初产妇167例(42.82%)、经产妇223例(57.18%);本市户籍105例(26.92%)、外地户籍285例(73.08%)。

2.2孕妇唾液P.gingivalis的检测结果

孕妇唾液P.gingivalis的实时PCR检测结果见图1,可见扩增曲线重复性好,溶解曲线单一峰代表引物特异性较好,以Ct<29为阳性;Ct≥29为阴性。

注:A为P.gingivalis real time PCR扩增曲线;B为P.gingivalis real time PCR溶解曲线。

2.3妊娠期P.gingivalis的感染状况及影响因素分析

390例孕妇中,P.gingivalis阳性176例,阴性214例,妊娠期P.gingivalis感染率为45.13%。单因素分析结果显示,孕妇年龄、文化程度、既往疾病史、不良孕产史、吸烟、胎儿数目、半年内牙周治疗、阴道炎与P.gingivalis感染显著相关(P<0.05),见表1。

表1 妊娠期P.gingivalis感染影响因素的单因素分析 [n(%)]

以妊娠期是否P.gingivalis感染为因变量,纳入单因素分析中差异有统计学意义的因素为自变量,进行多因素Logistic回归分析。结果显示,相对于年龄<35岁,年龄35～<40岁、≥40岁孕妇P.gingivalis感染的风险均增加(OR=1.674,95%CI:1.058～2.648,P<0.05;OR=2.085,95%CI:1.026～4.238,P<0.05);吸烟的孕妇P.gingivalis感染的风险是未吸烟孕妇的2.916倍(OR=2.916,95%CI:1.051～8.094,P<0.05),但曾经吸烟对比从未吸烟的孕妇无统计学差异(P>0.05);低文化程度(高中及以下)、不良孕产史、患有阴道炎(OR=2.017,95%CI:1.310～3.105;OR=1.788,95%CI:1.017～3.144;OR=1.877,95%CI:1.217～2.896)均是妊娠期P.gingivalis感染的独立危险因素(P<0.05)。但在控制了年龄、文化程度、吸烟等因素后,半年内有牙周治疗并不是P.gingivalis感染的保护因素(P>0.05),见表2。

表2 妊娠期P.gingivalis感染影响因素的Logistic回归分析

2.4感染组与对照组的孕期情况、分娩结局的比较

两组间产检次数、孕期增重、妊娠期高血压、胎膜早破、产后出血、低出生体重、新生儿感染情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)。但感染组GBS阳性、子痫前期、GDM、早产、FGR的发生率明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 两组孕期情况、分娩结局的比较

2.5妊娠期P.gingivalis感染对不良妊娠结局的影响

将至少出现子痫前期、GDM、早产、FGR其中一种,定义为不良妊娠结局,以是否有不良妊娠结局为因变量,纳入感染组、对照组间有统计学差异的因素为自变量,纳入多因素Logistic回归分析。结果显示,在控制了年龄、双胎、不良孕产史、GBS阳性等因素后,P.gingivalis感染明显增加了不良妊娠结局的发生风险(OR=2.175,95%CI:1.291～3.662),P.gingivalis感染的孕妇不良妊娠结局的发生率是未感染孕妇的1.778倍(RR=1.778,95%CI:1.223～2.432),见表4。

表4 不良妊娠结局影响因素的Logistic回归分析

3讨论

妊娠期常见的牙周致病菌有:牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)、中间普氏菌(P.intermedia)、伴放线聚集杆菌(A.actinomycetemcomitans)、具核梭杆菌(F.nucleatum)等。P.gingivalis是一种革兰阴性厌氧菌,具有菌毛、牙龈素、脂多糖等多种毒力因子,直接入侵牙周或母胎组织,造成全身和胎盘组织的免疫环境失调和氧化应激,或释放细菌产物间接通过炎症介质等传播到胎儿-胎盘单位[11],导致早产、子痫前期、早产低出生体重儿等多种不良妊娠结局[6-8,14]。Amarasekara等[15]通过鉴定、比较子痫前期与正常孕妇胎盘组织中的细菌,发现P.gingivalis存在子痫前期孕妇的胎盘组织中,而正常孕妇胎盘中均未发现P.gingivalis;Vanterpool等[16]通过免疫荧光组织法在胎盘、脐带标本中检测P.gingivalis并定位,结果显示脐带P.gingivalis感染与子痫前期显著相关,胎盘中的P.gingivalis与早产显著相关,提示胎盘绒毛间质、脐带P.gingivalis感染可能是不良妊娠结局的重要因素。因此,研究妊娠期女性P.gingivalis的感染状况及对不良妊娠结局的影响,对通过改善口腔健康预防不良妊娠结局的发生具有重要的临床意义。

3.1妊娠期P.gingivalis感染对不良妊娠结局的影响

本研究在控制了混杂因素后,结果显示P.gingivalis感染明显增加了子痫前期、GDM、早产、FGR不良妊娠结局的风险,可能作用机制主要包括①P.gingivalis与绒毛外滋养层细胞凋亡有关,Ren等[3]通过P.gingivalis感染人绒毛外滋养层细胞(HTR8/SVneo细胞),发现P.gingivalis诱导炎性因子IFN-γ和IL-8分泌,通过激活ERK1/2和P38信号通路,导致人绒毛外滋养层细胞凋亡;Hirohata[4]等将HTR8/SVneo细胞接种于含有P.gingivalis的培养基,发现P.gingivalis能够抑制滋养层细胞的侵袭和随后的血管重塑,从而影响胎盘生长及胎儿健康,导致子痫前期、FGR等多种不良妊娠结局。②P.gingivalis感染与氧化应激有关,Napa等[17]发现P.gingivalis脂多糖能诱导牙龈成纤维细胞线粒体含量增加、活动增强,产生大量过氧化氢(H2O2),H2O2等活性氧在血浆及胎盘中显著增加,与抗氧化剂的平衡失调,在子痫前期的发生中起重要作用[18]。③P.gingivalis可能改变肠道菌群,引起糖代谢异常、胰岛素抵抗,参与了GDM的发病机制,且与体内血糖水平呈正相关[19-20]。张欣等[21]探讨口腔菌群、肠道菌群与GDM的关系,结果显示P.gingivalis与口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)血糖水平显著正相关。

目前发现P.gingivalis感染导致不良妊娠结局的可能作用途径主要有2种:①P.gingivalis破坏牙周组织,血行播散或直接入侵母胎组织[15-16];②P.gingivalis作为病原菌,间接通过细菌产物或炎性介质的释放进入母体循环达到母胎界面,从而增加不良妊娠结局的发生[11]。

3.2妊娠期P.gingivalis感染的高危因素

本研究结果显示,妊娠期P.gingivalis感染率高达45.13%,与2014年陈琳等调查的上海市孕妇牙周病患病率为49.6%相近,但杨秀巧等[22]通过调查380名妊娠期妇女显示,妊娠期牙周病患病率为87.1%,数据差距之大的原因可能与临床对牙周病的主观诊断不统一或调查对象所处的妊娠周期不同有关,妊娠中晚期孕妇比早期更容易患牙周病,但本研究对象选择了妊娠早期孕妇,原因为:①本研究目的为早干预、早治疗,从而降低不良妊娠结局;②P.gingivalis感染在妊娠早期就干扰了绒毛外滋养层细胞向子宫血管侵袭,影响妊娠过程中子宫螺旋动脉重塑,导致不良妊娠结局[4-5,23]。

既往研究发现,妊娠牙周病与年龄[22]、文化程度[24-25]、吸烟[26]有关。杨秀巧等[22]将孕妇年龄按20～27岁、28～35岁和35岁以上进行年龄分组,研究表明随着妊娠妇女年龄的增大,牙周炎症状况加重。本研究结果显示,高龄、低文化程度、吸烟同样是妊娠期P.gingivalis感染的危险因素,年龄越大,其感染风险越大,与妊娠期牙周病相同。但本研究还发现,阴道炎、既往不良孕产史均是妊娠期P.gingivalis感染的独立危险因素,可能原因:①引起慢性牙周炎症的细菌包括革兰阴性杆菌和厌氧菌,与细菌性阴道病患者的细菌相似[27];②既往不良孕产史与P.gingivalis感染可能为双向关联的关系,一方面,P.gingivalis感染引起前次不良妊娠结局,另一方面,既往不良妊娠结局可能引起了隐匿的胰岛素抵抗、炎症等,使机体对P.gingivalis易感性增加。

3.3妊娠期P.gingivalis感染的治疗

妊娠期牙周基础治疗可改善孕妇的口腔微生态,本研究显示,半年内有牙周治疗史的孕妇P.gingivalis感染率明显降低,但在排除了其他因素后,半年内有牙周治疗史并不是P.gingivalis感染的保护因素。关于孕期牙周治疗能否减少不良妊娠结局的发生目前尚无定论,Liu等[28]研究发现妊娠期牙周治疗明显降低GDM的发生率;Bi等[29]系统地评估了妊娠期牙周治疗对妊娠结局的影响,结果显示妊娠期牙周治疗可降低围产期死亡率和早产的风险,并提高新生儿出生体重;但也有研究发现,妊娠期牙周基础治疗并不能降低不良妊娠结局的风险[30-31],其原因可能为:①P.gingivalis在妊娠早期就参与了不良妊娠结局的发病机制;②治疗时间太晚,P.gingivalis已经感染了胎盘等组织,牙周基础治疗不能有效地抑制。因此,如何同时抑制口腔、胎盘中的P.gingivalis及选择P.gingivalis感染的治疗时机,从而预防不良妊娠结局的发生,需要进一步深入的研究。

综上所述,妊娠期P.gingivalis的感染率高,是不良妊娠结局发生的危险因素,应关注妊娠期P.gingivalis的感染状况及口腔卫生状况,尤其加强高龄、低文化水平、吸烟、患有阴道炎、既往不良孕产史高危人群的口腔健康教育,从而早期干预、治疗,降低不良妊娠结局的发生,提高人口出生质量。但本研究局限于单中心,地域差异无法兼顾,且纳入的影响因素仅包括孕妇的基本资料,未包含平时口腔保健状况及习惯,可能存在选择偏倚,尚需更大样本,扩大范围进一步探讨。