基于网络药理学探讨苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的作用机制Δ

王胜杰,郭 军,洪志明,王 全,曾杨玲,陈子龙,邱俊峰,翁浩伟

(1.广州中医药大学,广州 510006; 2.深圳市中医院男科,广东 深圳 518033; 3.广州中医药大学第四临床医学院,广东 深圳 518033; 4.中国中医科学院西苑医院男科,北京 100091)

少弱精子症是当前男性不育症的重要病因之一。目前的研究结果表明,少、弱精子症在男性不育症中占33%,因其发病机制尚不明确,临床上亦缺乏确切有效的治疗手段[1]。在传统中医理论中,少弱精子症多属于“精少”“精薄”等疾病范畴,其核心病机在于肾精亏损,生殖机能减退,导致生精无源。少弱精子症的中医治疗以补肾健脾为基本原则,温养阳气、滋补精血为重要手段[2]。前期研究结果表明,苁蓉益肾颗粒温阳益肾、滋阴填精、补固肾气,可以提高精子密度、精子活力及成活率,显著改善少弱精子症患者的精子质量,具有一定的临床疗效[3]。本研究将基于中药分子机制的生物信息学分析工具——BATMAN-TCM在线分析平台,采用网络药理学的方法,从生物分子水平探讨苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的作用机制。

1 资料与方法

1.1 活性成分获取及靶点预测

以“肉苁蓉”“巴戟天”“菟丝子”“五味子”“茯苓”和“车前子”为关键词,从BATMAN-TCM数据库、PubChem数据库中检索苁蓉益肾颗粒的药物成分,并以预测评分≥25% 、P>0.05为限制条件,筛选出药物中的活性成分并预测与活性成分相关的作用靶点。

1.2 药物-疾病作用靶点的筛选

以“oligospermia”“asthenospermia”为关键词,从GeneCards数据库、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM)数据库和PharmGkb数据库中检索少精子症与弱精子症的疾病靶点,利用MLC在线工具将收集到的疾病靶点与“1.1”中得到的药物作用靶点相互交集,以获取苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的潜在靶点,并绘制相应的韦恩图。

1.3 靶点间相互作用分析

将获取到的靶点导入String平台,物种限定选择为“人(Homo sapiens)”的选项,并对共有基因构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,然后将综合得分>0.9的潜在靶点基因数据导入Cytoscape v3.9.0软件进行图形化展示,并应用CytoNCA、CytoHubba插件,筛选出综合向心度排序居前10位的靶点基因作为苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的核心靶点。

1.4 网络图构建

将“1.2”中收集到的苁蓉益肾颗粒有效成分及成分相关靶点基因数据导入Cytoscape软件,构建药物-有效成分-靶点-疾病网络,节点与节点之间的连接代表各因素间的相互作用。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

设定阈值P<0.05,利用Hiplot可视化平台对核心靶点基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并绘制柱状图与气泡图。

2 结果

2.1 药物活性成分获取及靶点预测

从BATMAN-TCM分析平台中筛选出的预测作用靶点共701个,与预测作用靶点相关的有效成分共101种,其中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、松果菊苷(echinacoside)和类叶升麻苷(acteoside)为苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的核心活性成分。

2.2 药物作用靶点的筛选

从GeneCards数据库、OMIM数据库和PharmGkb数据库中检索少精子症与弱精子症的疾病靶点,利用MLC在线工具将3个数据库收集到的疾病靶点取并集后,获得与少弱精子症相关的作用靶点共859个。将上述疾病靶点与“1.1”中获取到的701个预测作用靶点相互交集并绘制韦恩图,最后获取苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的靶点基因共69个,见图1、表1。

图1 苁蓉益肾颗粒和少弱精子症的靶点基因韦恩图Fig 1 Venn diagram of target genes of Congrong Yishen granules and oligospermia and asthenospermia

表1 苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的靶点基因Tab 1 Target genes of CRYSG in the treatment of oligospermia and asthenospermia

2.3 靶点间相互作用分析

将获取的69个靶点基因导入String平台,构建共有基因的PPI网络,见图2;然后将综合评分>0.9的数据导入Cytoscape软件进行图形化展示,见图3。同时调用CytoNCA、CytoHubba插件,筛选出综合向心度排序居前10位的靶点基因作为苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的核心靶点,具体包括胰岛素基因(INS)、肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)、白细胞介素1β(IL-1β)、基质金属肽酶9(MMP9)、过氧化物酶基因(CAT)、肿瘤蛋白p53(TP53)、血管紧张素转化酶(ACE)、雌激素受体1(ESR1)和干扰素γ基因(IFNG)。

图2 苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的相关靶点PPI网络图Fig 2 PPI network of related targets of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

图3 苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的核心靶点PPI网络图Fig 3 PPI network of core targets of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

2.4 网络图构建

将“1.2”中收集到的苁蓉益肾颗粒有效成分及成分相关靶点基因数据导入Cytoscape 软件,构建药物-有效成分-靶点-疾病网络,见图4。

紫色原点为药物-苁蓉益肾颗粒,绿色原点为有效活性成分,蓝色原点为预测靶点,红色原点代表疾病-少弱精子症,黑边代表靶点间的互相作用关系the purple point represents the drug-Congrong Yishen granules, and the green points represent the active component. The blue points represent the predicted target, the red points represent the oligospermia and asthenospermia, and the black edges represent the interaction among different targets图4 苁蓉益肾颗粒的药物-有效成分-靶点-疾病网络Fig 4 Drug-active component-target-disease network of Congrong Yishen granules

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Hiplot可视化平台(https://hiplot.com.cn/)对PPI网络中的核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG生物通路富集分析,并绘制相应的点状图和柱状图,见图5。根据P值(P<0.005)列出前20条GO途径,苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的作用机制具体涉及类固醇代谢、类固醇激素反应、细胞酮代谢及调控凋亡信号通路等生物分子;KEGG通路富集分析结果提示,苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的作用机制主要涉及核因子κB(NF-κB)信号通路、甲状腺激素信号通路、雌激素信号通路及白细胞介素17信号通路等。

3 讨论

《辨证录·种嗣门》中记载:“男不能生子者有六病,一精寒,二气衰,三精少,四痰多,五相火盛,六气郁。”其中明确指出少精、弱精(精寒)是男性不育症的重要病因之一。在传统中医理论中,少弱精子症多属于“精少”“精薄”“精清”和“精冷”等疾病范畴,其核心病机在于肾精亏损,生殖机能减退,导致生精无源,男子精少精弱而不育,病因可分虚实,虚则多为先天禀赋不足,或房事不节,或久病及肾;实则饮食不节,或瘀血阻络,精道不畅等。少弱精子症的中医治疗以补肾健脾为基本原则,温养阳气、滋补精血为重要手段[4]。苁蓉益肾颗粒化裁自《太平圣惠方》卷二十六中的“五味子丸”,由肉苁蓉、巴戟天、菟丝子、五味子、茯苓和车前子6味药物组成,具有补肾填精的功效,常用于治疗肾气不足、腰膝酸软、记忆减退、头晕耳鸣和四肢无力等。方中肉苁蓉味甘酸咸,性微温,可滋补元阴、填精益髓,为君药。巴戟天辛甘,性温益阳;菟丝子味甘性平,专主男子肾虚精寒,两者合用,可壮阳强精,共为臣药。五味子味酸甘,性温,酸温以收敛元阳,固护心肾之气;茯苓味淡性平,功能健脾气、安心神,两者共为佐药。车前子味甘性寒,气清凉,能泄肾中虚火,并防诸药滋腻碍脾,为使药。诸药合用,共奏滋阴生精、温阳强精之功,以期温煦精室,强精生子。前期研究结果表明,苁蓉益肾颗粒可以通过调节内分泌及增加机体代谢,提高精子密度、精子活力及成活率,显著改善少弱精子症患者的精子质量,具有一定的临床疗效[3]。

A.点状图;B.柱状图A.scatter diagram; B.bar chart图5 苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的GO分子功能和KEGG通路富集分析图Fig 5 GO molecular function and KEGG pathway enrichment analysis of Congrong Yishen granules in the treatment of oligospermia and asthenospermia

基于网络药理学的研究方法及参考相关文献,本研究从BATMAN-TCM数据库、PubChem数据库中检索到苁蓉益肾颗粒的药物活性成分共101种,总结其治疗少弱精子症的作用靶点共69个。在苁蓉益肾颗粒的活性成分中,β-谷甾醇、松果菊苷和类叶升麻苷为苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的核心活性成分。β-谷甾醇是植物甾醇类成分,属于四环三帖类化合物,其广泛存在于自然界中的各种植物油、坚果等植物种子中,可通过与雌激素受体相结合,抑制NF-κB的激活,改善促性腺激素释放激素分泌量减少,继而促进雄激素的分泌与精子的生成,并提高哺乳动物的精子体外获能效果[5-6]。松果菊苷是良好的抗氧化成分,能够清除自由基并且消除氧化应激损伤。王莺等[7]发现,松果菊苷通过提高醋酸铅中毒模型大鼠睾丸组织内乳酸脱氢酶含量,提高超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽水平,进而修复睾丸组织氧化应激损伤情况,提高睾丸组织的抗氧化能力,恢复睾丸正常的生精功能;Jiang等[8]发现,松果菊苷通过进入下丘脑与雄激素受体靶向结合,并抑制雄激素受体活性中心,阻断负反馈调节,促进正反馈调节,提高睾酮和促黄体生成素的水平,进而增加哺乳动物的精子数量。类叶升麻苷是管花肉苁蓉的提取物之一,马晶晶等[9]发现,类叶升麻苷可以缩短肾阳虚小鼠模型阴茎勃起潜伏期,增加肾阳虚小鼠模型的精子数量,显著提高性器官脏器系数,改善睾丸形态结构;推测其作用机制可能与调控生殖激素水平相关,从而改善机体的生精功能[10]。苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的作用靶点共69个,筛选出综合向心度排序居前10位的核心靶点有INS、TNF、PTGS2、IL-1β、MMP9、CAT、TP53、ACE、ESR1和IFNG。其中,ESR1的正常表达对男性生殖功能起着重要的调控作用。研究结果表明,ESR1基因mRNA低表达是精液质量的危险因素之一[11]。ESR1基因所表达的雌激素受体α可通过配体依赖和非依赖途径,调节精子发生和精子成熟过程,尤其在调节睾丸输出小管对液体的重吸收中起到重要作用[12-13]。动物实验结果显示,在ESR1基因敲除小鼠模型中,睾丸输出小管和附睾的微环境改变,可导致附睾精子浓度和活力降低[12]。丁涛[14]发现,在精子发生阻滞的不育患者中,ESR1基因在支持细胞表达中下调。由此可见,改善ESR1基因mRNA低表达,有可能是苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的作用靶点之一。

通过构建PPI网络,对苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的核心作用靶点进行GO功能富集分析:(1)生物进程主要体现在促进类固醇和细胞酮代谢过程,增强细胞对类固醇激素的反应,增强类固醇生物合成的过程,并体现在对细胞凋亡信号通路的负调控;(2)细胞组成提示,靶点主要作用于细胞的跨膜转运蛋白复合物、转运复合物、离子通道复合物、钠通道复合物、高尔基体、髓鞘和T小管等部位;(3)分子功能主要体现在对配体门控钠离子通道活性、核受体活性、类固醇羟基酶活性、环核苷酸磷酸二酯酶活性、3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶活性和3′,5′-环-AMP磷酸二酯酶活性的调控。对核心靶点进行KEGG通路富集分析,结果提示:苁蓉益肾颗粒所调节的分子功能主要涉及类固醇生物合成途径、NF-κB信号通路、雌激素信号通路和白细胞介素17信号通路等。其中类固醇生物合成途径是苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的核心通路之一。精子的发生、获能离不开雄激素的调控。雄激素是类固醇化合物,与雄激素结合蛋白相结合时,使生精小管中的雄激素集中浓缩于管腔中,以刺激生精小管生成精子,同时可以促进精子的成熟,保持精子的活力[15]。王启新[10]发现,肉苁蓉通过调节中枢神经递质的释放,维持下丘脑-垂体-肾上腺轴相关激素水平的稳定,促进睾酮的分泌和释放,增加小鼠的睾丸及其副性腺器官的重量,进而改善小鼠的生殖能力。相关研究报道,肉苁蓉中所含的苯乙醇苷能够促进雄激素的分泌,从而提高精子质量,改善生殖功能[16]。以此推测,苁蓉益肾颗粒可能通过调节内分泌轴的功能,促进雄性激素和促性腺激素的分泌,改善睾丸生精功能,以此起到治疗少弱精子症的作用。同时,苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症涉及NF-κB信号通路。NF-κB信号通路在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起到关键性作用[17]。邱娴娴等[18]发现,PM2.5可通过诱导NF-κB炎症信号通路激活,上调白细胞介素6、TNF-α等炎症因子的表达,放大炎症级联,造成睾丸组织的炎性损伤,从而导致雄性大鼠生殖功能障碍。叶臻等[19]发现,通过激活NF-κB通路,提高NDRG2炎症因子水平,可引起纯睾丸支持细胞综合征患者的睾丸中间质细胞的大量凋亡。由此推测,苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的作用机制,有可能是通过抑制NF-κB信号通路激活,下调相关炎症因子的水平,改善睾丸及附睾的炎症损害,以达到治疗的目的[20]。

本研究基于网络药理学的研究方法,对苁蓉益肾颗粒治疗少弱精子症的分子作用机制进行了探讨,同时也说明了中药复方治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路的特点,体现了中药复方的整体性和独特性,为后续进一步的实验研究、探讨苁蓉益肾颗粒治疗疾病的作用机制提供了理论支持。