基于网络药理学研究妇科调气解毒方对慢性子宫内膜炎的治疗作用机制Δ

陈继香,李 宁,钟传梅,宇文思

(1.广西中医药大学研究生院,南宁 530000; 2.广西中医药大学附属国际壮医医院妇科,南宁 530000)

慢性子宫内膜炎(chronic endometritis,CE)是一种以黏膜间质水肿、局灶性或弥漫性充血、子宫内膜息肉和间质浆细胞浸润为特征的持续性子宫内膜炎症[1]。CE的患病率在不孕妇女中为2.8%～56.8%,与不良孕育结局及子宫内膜异位症等有着明确相关性[2-4]。该病严重影响了妇女的健康和生活质量,同时造成了社会家庭经济负担,子宫内膜炎的主要病因为常见细菌感染,如大肠杆菌、链球菌和葡萄球菌等,脂多糖(LPS)为细菌主要成分[5]。目前对于CE尚无普遍接受的标准化的诊断指南,也没有统一标准化的治疗方案[6-7]。国内外优先推荐抗炎治疗[8]。但目前的治疗方法存在耐药、反复发作以及有一定的不良反应等问题。因此,探究子宫内膜炎的发病机制,以进行有效治疗十分迫切。妇科调气解毒方作为经验方在临床中治疗CE多年,同时有改善月经、提高受孕率等效果,但对其治疗机制缺乏深入研究。本研究在网络药理学基础上推断其作用的通路及靶点,并建立动物模型对其作用机制进行验证,为临床用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 妇科调气解毒方成分库的建立和关键靶点的筛选

从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http:// tcmspw.com/)和中药与化学成分数据库[9]中检索白芍、白术、布渣叶、苍术、柴胡、陈皮、甘草、荆芥穗、救必应、绵萆薢、山药和土茯苓,寻找中药化学组成成分时设置口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18对化合物进行筛选;同时,从已发表的论文中检索黄花倒水莲、五指毛桃主要活性成分;将查询得到的CAS号和Pubchem Cid号通过PubChem[10]生成2 D蛋白质靶点结构图,通过SwissADME[11]对其活性成分进行筛选,根据药动学,排除胃肠道吸收度低的蛋白质靶点,最后通过TCMSP和Uniprot数据库[12]将靶蛋白名转换为标准基因名,得到化合物相应关键靶点的基因;运用SwissTargetPrediction[13]进行靶点预测,获得妇科调气解毒方靶点基因。

1.2 子宫内膜炎疾病靶点的收集

以“Endometritis”“Endomyometritis”为关键词,使用GeneCard[14]、DrugBank[15]和DisGeNET[16]收集子宫内膜炎相关的目标基因;使用Jvenn在线工具[17]将药物预测的靶点与疾病的靶点进行映射,获得妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎的潜在靶点。

1.3 重叠基因的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络、药物-化合物-作用靶点-疾病网络的构建

为探索妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎蛋白靶点之间的相互作用并识别关键蛋白,将重叠的潜在靶点通过STRING 11.5数据库[18],物种设置为选择“多种蛋白质”后的“智人”;其他参数为默认值,利用Cytoscape 3.7.1软件绘制交互网络,设置节点大小和颜色来反映度值的大小,设置边的粗细来反映组合分数的大小,得到最终的PPI网络。

1.4 重叠基因的基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

为说明和了解妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎的潜在机制,使用Metascape在线平台[19],以P<0.01对重叠基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,筛选排序靠前的生物过程和通路,并对富集分析结果进行可视化处理。

1.5 仪器

SIM-F140AY65-PC型制冰机(日本Panasonic公司);PowerPacTM通用电泳仪电源(美国BIO-RAD公司);Fluorchem E型超灵敏化学发光成像系统(美国Protein Simple公司);5430R型高速冷冻离心机(艾本德中国有限公司);DW-86-L290-80 ℃冰箱(澳柯玛股份有限公司);Light Cycler 96型全自动实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司);Infinite M200 pro型多功能微孔板检测仪酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.6 药品与试剂

妇科调气解毒方配方组成:黄花倒水莲15 g,五指毛桃15 g,麸炒白术30 g,山药30 g,救必应15 g,土茯苓15 g,布渣叶15 g,棉萆薢10 g,麸炒苍术15 g,白芍6 g,车前子(布包)9 g,柴胡3 g,荆芥穗3 g,甘草6 g,陈皮5 g。将饮片水煎成汤剂高、中、低3个浓度:3.84、1.92、0.96 g/mL,1 mL含生药1.92 g,由广西中医药大学附属国际壮医医院制剂科代煎。

盐酸左氧氟沙星片(浙江京新药业股份有限公司,国药准字H19990060,规格为0.1 g)。LPS 10 mg(美国Sigma公司,批号为L2630);髓过氧化物酶(MPO)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、白细胞介素(IL)6 ELISA试剂盒、蛋白定量试剂盒、羊抗兔IgG、ECL化学发光底物试剂盒(北京兰杰柯科技有限公司,批号分别为MU30238、MU30044、BL521A-1、BL003A、BL523A);IL-1β ELISA试剂盒(武汉贝茵莱生物科技有限公司,批号为MU30369);兔抗Toll样受体4(TLR4)抗体、兔抗核因子κB(NF-κB) P65多克隆抗体、P-NF-κB P65多克隆抗体(北京索莱宝科技有限公司,批号分别为K003881P、K003407P、K006209P);10% PAGE彩色凝胶超快速配制试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号为G2043-50T);定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒、逆转录试剂盒(武汉诺华生物科技有限责任公司,批号分别为Q204、R202);RNA总提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司,批号为DP424]。

1.7 动物选取与模型建立

所有实验动物的处理均遵循国家科学技术委员会颁布的《动物质量管理办法》实施。选取SPF级8周昆明雌性小鼠60只,体重30～35 g,将小鼠置于SPF级实验室,室内温度20～25 ℃,湿度50%～60%,普通饲料、水饲养适应性饲养1周后,随机抽取10只为空白组,剩余50只随机分为模型组,妇科调气解毒方低、中、高剂量组,以及西药组。妇科调气解毒方生药为192 g/付,成人口服剂量为192 g/d。根据等效剂量系数折算法小鼠日剂量为29.12 g/kg,因此,妇科调气解毒方低、中及高剂量组分别按14.56、29.12及58.24 g/kg连续灌胃5 d,西药组同理推算,1日2次,空白组灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。5 d后给小鼠子宫腔手术注入LPS(2.5 μg/μL)25 μL[20-21]。24 h后眼球取血后离心,脱颈椎处死小鼠后取组织置于-80 ℃冰箱待测相关指标。

1.8 网络药理学结果的验证

根据ELISA试剂盒的步骤对网络药理学对应的关键靶点进行检测,通过Real-time PCR及蛋白质印迹法对关键信号通路中的关键蛋白和基因的表达水平进行检测。TLR4、NF-κB及P65 NF-κB的引物序列见表1。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 妇科调气解毒方的化合物与疾病的靶基因鉴定

妇科调气解毒方由黄花倒水莲、五指毛桃、白术和山药等15味中草药组成。按照筛选条件去除重复、冗杂以及未找到靶点的成分后,最终得到化学成分黄花倒水莲5个,五指毛桃48个,白术3个,山药11个,救必应4个,土茯苓12个,布渣叶7个,绵萆薢2个,苍术3个,白芍8个,陈皮5个,车前子5个,柴胡12个,荆芥穗7个,甘草87个,共219个化合物。利用数据库查询主要化合物调控的靶点信息,筛选出对应的作用靶点698个,通过Uniprot对靶点和基因信息进行标准化。从GeneCards、DrugBank和DisGeNET数据库中共鉴定出151个子宫内膜炎相关的靶基因。

2.2 妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎的潜在靶点

运用Jvenn在线工具,将妇科调气解毒方主要活性成分调控的靶点与子宫内膜炎的疾病靶点取交集,最终得到36个靶点,见图1。

图1 妇科调气解毒方-子宫内膜炎靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of gynecological Tiaoqi Jiedu formula-endometritis target

图2 妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎交接靶点PPI网络Fig 2 PPI network of handover targets of gynecological Tiaoqi Jiedu formula in the treatment of endometritis

2.3 妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎潜在靶点的PPI网络构建

为探索36个抗子宫内膜炎靶基因的相关性,构建了1个PPI网络。PPI网络中的节点代表蛋白质,边代表蛋白质之间的相互作用,节点的大小和颜色的深浅代表度值;节点的度值越高,其在网络中的作用就越重要;每条边表示蛋白与蛋白之间的相互作用,线条越多表示关联度越大,见图2。由图2可知,IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)、半胱天冬酶3(CASP3)、环加氧酶2(PTGS2)、IL-1β、基质金属蛋白酶(MMP)9、CXC趋化因子配体8(CXCL8)、IL-10、缺氧诱导因子1a(HIF1A)的度值显著高于其余靶点,在PPI网络中起着重要的联系作用,可能是妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎最主要的潜在靶点。

2.4 药物-化合物-作用靶点-疾病网络的构建

运用Cytoscape 3.7.1软件构建药物-化合物-作用靶点-疾病网络,见图3。图3中,中间代表疾病,第2圈代表交接作用靶点,第3圈代表药物名称,每条边表示化合物和靶点之间相互作用的关系,根据节点度值等网络拓扑学特征进行核心节点的筛选,节点越大,颜色越深,代表化合物的作用越大。结果显示,槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)和β-谷甾醇(beta-sitosterol)等化合物在整个网络中发挥着关键作用,可能是妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎的核心化合物。

2.5 妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎潜在靶点的GO分析

GO富集分析的结果包括生物过程、分子功能和细胞成分3类。GO生物功能分析共包含690条富集结果(P<0.01),其中生物过程636条,分子功能43条,细胞成分11条。将数据可视化,Gene Radio指差异表达基因中位于term entry的基因数与所有基因中位于term entry的基因总数的比值。气泡的大小表示基因的数量(count值),气泡越大,该富集的基因数量越多。气泡颜色的深浅表示富集程度(P值);颜色越红,表示富集程度越高。结果表明,妇科调气解毒方可能是对炎症反应调节、信号受体调节、细胞因子介导的信号通路、细胞因子活子和生长因子受体结合等生物过程进行干预的,见图4(A—C)。

图3 药物-化合物-作用靶点-疾病网络图Fig 3 Drug-compound-target-disease network

A. 生物过程;B.细胞成分;C.分子功能;D.KEGG通路A. biological process; B. cellular component; C. molecular function; D. KEGG pathway图4 妇科调气解毒方治疗子宫内膜炎潜在靶点的GO和KEGG通路富集分析Fig 4 GO and KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of gynecological Tiaoqi Jiedu formula in the treatment of endometritis

2.6 KEGG通路富集分析

对重叠基因进行KEGG通路富集分析,以P<0.01进行筛选,共获得了77条信号通路,对P值从小排序居前20位的信号通路进行可视化,见图4(D)。结果表明,潜在靶点主要参与NF-κB信号通路、晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路和NOD-like受体信号通路等,与子宫内膜炎发病机制报道相吻合。

2.7 小鼠造模一般情况

空白组小鼠精神状态佳,反应灵敏,饮食饮水正常、毛发光泽、大小便正常,阴道分泌物正常。模型组、低剂量组小鼠精神萎靡少动,反应迟钝,饮食饮水量变少,阴道分泌物增多。其余组无明显异常。

2.8 妇科调气解毒方对MPO及炎症因子的影响

与空白组相比,模型组小鼠MPO活性明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,中剂量组、高剂量组及西药组小鼠MPO活性明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01),低剂量组小鼠MPO活性与模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组相比,模型组小鼠炎症因子IL-6、IL-1β含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,低剂量组小鼠IL-6含量明显降低(P<0.05),中剂量组、高剂量组及西药组小鼠IL-6、IL-1β含量明显降低(P<0.01),差异均有统计学意义。对高、中、低剂量组及西药组之间的MPO活性、IL-6及IL-1β含量进行比较,高剂量组与西药组的差异无统计学意义(P>0.05),其余差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组小鼠血清细胞因子水平比较Tab 2 Comparison of serum cytokine levels in each group

2.9 Real-time PCR检测TLR4/NF-κB信号通路中P65、磷酸化蛋白65(P-P65)及TLR4 mRNA的表达

GAPDH和NF-κB信号通路中,P65、P-P65及TLR4的溶解曲线均为重叠的单峰,表示PCR产物单一,特异性好,见图5。根据得出的内参平均Ct值及目的基因平均Ct值算出ΔCt,最后用ΔΔCt值为相对表达量。结果显示,与空白组比较,模型组小鼠子宫组织内P-P65、TLR4 mRNA的表达量显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。与模型组比较,低剂量组不能明显抑制P-P65及TLR4 mRNA的表达(P>0.05),中、高剂量组及西药组小鼠P-P65、TLR4 mRNA表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01,P<0.001),各组小鼠P65 mRNA表达的差异均无统计学意义(P>0.05),见图6。

A.GAPDH;B.P-P65;C.P65;D.TLR4A.GAPDH;B.P-P65;C.P65;D.TLR4图5 TLR4/NF-κB中实时荧光定量PCR溶解曲线Fig 5 Dissolution curve of real-time PCR in TLR4/NF-κB

A. P-P65 mRNA;B.P65 mRNA;C.TLR4 mRNA;与空白组比较,##P<0.01,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001A. P-P65 mRNA; B. P65 mRNA; C. TLR4 mRNA; vs. blank group, ##P<0.01, ###P<0.001; vs. model group, *P<0.05, **P<0.01,***P<0.001图6 各组P-P65、P65及TLR4 mRNA相对表达量的比较Fig 6 Comparison of relative expression of P-P65, P65 and TLR4 mRNA in each group

2.10 蛋白质印迹法检测TLR4/NF-κB信号通路中P-P65、P65及TLR4 蛋白表达量

与空白组比较,模型组小鼠子宫组织NF-κB P65磷酸化水平(P-P65)及TLR4蛋白表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,低、中剂量组小鼠对NF-κB P65磷酸化水平及TLR4蛋白表达的抑制不明显(P>0.05);高剂量组、西药组能显著抑制P-P65及TLR4蛋白表达量,与模型组的差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);其中蛋白P65表达的差异无统计学意义(P>0.05),见图7。

与空白组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01vs. blank group, ##P<0.01;vs. model group, *P< 0.05, **P<0.01图7 各组小鼠子宫NF-κB信号通路相关蛋白表达Fig 7 Expression of NF-κB signaling pathway-related proteins in the uterus of mice in each group

3 讨论

子宫内膜炎的发生不是一条通路的改变造成的,其中涉及多条通路间相互作用,但筛选出的重要潜在靶点(见图2)均可激活NF-κB信号通路。研究结果发现,TLR4在羊膜细胞、滋养细胞、母-胎界面蜕膜细胞及子宫内膜中表达极高,起到调节免疫、炎症和妊娠着床的作用[22]。LPS是激活TLR信号通路的主要模式,一旦被激活就会触发炎症通路上调,尤其是NF-κB通路,进而引起IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症因子的表达上调,以及MPO的激活[23-24]。因此,NF-kB信号通路在CE免疫系统中起关键作用。在ELISA的检测结果中,妇科调气解毒方作用于CE的重要靶点,即显著的向下调控炎症因子IL-1β、IL-6的表达及较少MPO的激活;同时检测由TLR4介导的NF-κB信号通路的重要基因及蛋白的表达,结果显示,与空白组比较,模型组显示基因及蛋白P-P65和TLR4的相对表达量明显增加。妇科调气解毒方中、高剂量组及盐酸左氧氟星组能显著地向下调控基因及蛋白P-P65及TLR4的表达。

在筛选的在活性化合物中(见图2),槲皮素综合评分远高于其他化合物。研究结果表明,槲皮素能被胃肠吸收且发挥抗氧化应激的作用[25];并且可抑制胆固醇诱导的细胞凋亡、线粒体功能障碍和炎症[26-28]。此外,槲皮素可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症因子的产生、细胞增殖和NF-κB活化;降低NLR家族及细胞焦亡相关蛋白(如 NLRP3、Caspase-1、GSDMD裂解的IL-1β)的表达水平[29]。

将妇科调气解毒方主要活性成分调控的靶点与子宫内膜炎的治疗靶点取交集,得到36个关键靶点,其中IL-6的度值最大,IL-6是一种多效性细胞因子[30-31]。目前研究结果表明,通过IL-6阻断能进行多种疾病的免疫治疗[32]。妇科调气解毒方可能从疾病通路的上游进行干预,通过抑制IL-6的表达,保护子宫内膜细胞的焦亡。同时作为重要作用靶点的CXCL8,具有血管生成、新的黄体生成及孕酮分泌的作用[33]。从而解释了临床中妇科调气解毒方在治疗CE的同时能改善月经异常及提高受孕率的作用机制。

综上所述,妇科调气解毒方可以通过多靶点、多通路、多途径协同作用治疗CE,并可以在疾病早期进行干预。本研究的不足之处是基于网络药理学进行的动物实验验证,与人体具有一定差异性。但本研究为今后进一步研究奠定了基础,为妇科调气解毒方在治疗CE的同时保护子宫内膜、提高受孕率提供了新的思路及临床用药依据。