基于Hedgehog信号通路探讨祛湿通络法抗非酒精性脂肪性肝病肝纤维化研究

刘颖，高展翔

（福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）肝纤维化由非酒精性脂肪性肝炎发展而来，随着病情进一步恶化，可发展为肝硬化，甚至肝癌［1］。研究表明，各种慢性肝病都可能伴有肝纤维化，12%～25%的慢性乙型肝炎肝纤维化患者5年内可进展为肝硬化［2］，严重威胁人类健康，因此及时逆转及阻断肝纤维化进展具有重大意义。但目前为止，临床仍缺乏疗效肯定的抗肝纤维化药物。中药具有多环节、多靶点的作用特点，对病理机制复杂的疾病可发挥综合优势，实践也证明中医药在抗器官纤维化中发挥了重要作用。本课题组前期研究发现，“茵陈三甲散”对防止非酒精性脂肪肝向肝纤维化转变有满意效果，而其作用机制尚不明确。本研究以Hedgehog（简称Hh）信号通路为靶点，研究“茵陈蒿汤”和“薛氏三甲散”及其合方“茵陈三甲散”干预NAFLD肝纤维化慢性炎症的过程，从而探究祛湿通络法作用于NAFLD肝纤维化的可能机制。

1 材 料

1.1 实验动物 8周龄SPF级C57BL/6J成年雄性小鼠60只，体质量（18±2）g，购自杭州医学院，许可证号为：SCXK（浙）2019-0002。在福建中医药大学实验动物中心SPF级饲养室饲养，合格证号为：SYXK（闽）2019-007。

1.2 实验药物 中药（茵陈、栀子、大黄、醋鳖甲、炮山甲、䗪虫、僵蚕、柴胡、桃仁）购自福建中医药大学附属福建省第三人民医院；秋水仙碱（上海源叶生物科技有限公司，批号：A05GS144308）。蛋氨酸胆碱缺乏（methionine-choline-deficient，MCD）饲料（无锡帆泊生物技术有限公司，批号：FB-A020820 02B）。

1.3 主要实验试剂 天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）、透明质酸（HA）、层黏蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原肽（PCⅢ）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：C010-2-1、C009-2-1、C019-1-1、H141-1-1、H148、H491-1）；HE染色液、Masson染色液（珠海贝索生物技术有限公司，批号：BA4025、BA4079）；BCA蛋白定量试剂盒、Western blot专用一抗和二抗稀释液（武汉博士德生物工程有限公司，批号：AR0198、AR1017）；qPCR检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：Q311-02）。

1.4 实验仪器 显微镜DM4000 B-LED（德国徕卡公司）；上转发光免疫分析仪UPF-3A（北京热景生物技术有限公司）；PCR仪（杭州米欧仪器有限公司）；转移脱色摇床（海门其林贝尔仪器制造公司）；超微量紫外可见分光光度计（杭州米欧仪器有限公司）；冷冻离心机（广州吉迪仪器有限公司）；琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 实验药物制备 茵陈蒿汤由茵陈18 g，栀子12 g和大黄6 g组成；薛氏三甲散由䗪虫10 g，醋鳖甲15 g，炮穿山甲3 g，僵蚕10 g，柴胡5 g和桃仁10 g组成；自拟方茵陈三甲散由茵陈18 g，栀子12 g，大黄6 g，醋鳖甲15 g，炮山甲3 g，䗪虫10 g，僵蚕10 g，柴胡5 g和桃仁10 g组成。将上述中药浸泡、煎煮、过滤、浓缩配制成药液（茵陈蒿汤浓度为0.7 g/mL、薛氏三甲散药液浓度1.1 g/mL、茵陈三甲散药液浓度1.8 g/mL），存于4 ℃冰箱里。

2.2 模型建立与评价 将小鼠分为正常组10只和造模组50只，造模组使用MCD饲料建立模型。MCD饲料造模是目前国际上公认的NAFLD造模方法，根据相关文献造模成功案例［3-4］，光镜下观察模型组肝组织形态学改变，出现肝组织结构紊乱，肝细胞脂肪样变、淋巴细胞浸润和肝细胞水肿，点灶状坏死、窦周纤维化，中央静脉区有大量胶原纤维沉积，表示造模成功。

2.3 动物分组及干预 将小鼠用随机数字表法分为正常组、模型组、西药组、祛湿组、通络组、祛湿通络组，每组各10只。根据实验动物标准体质量剂量折算表［5］，正常组和模型组给予10 mL/kg蒸馏水灌胃；祛湿组按7.4 g/kg茵陈蒿汤灌胃；通络组按10.9 g/kg薛氏三甲散灌胃；祛湿通络组按18.3 g/kg自拟方茵陈三甲散灌胃；西药组按0.1 mg/kg秋水仙碱灌胃。于每日上午9时灌胃，每日1次，连续8周。

2.4 标本采集 末次灌胃结束，各组小鼠禁水、禁食12 h后称体质量。采用腹腔注射20%乌拉坦深度麻醉，摘取眼球取血，分离血清（3 000 r/min，15 min）置于-20 ℃低温冰箱保存。分别取肝左叶组织放于冻存管和4%多聚甲醛中，冻存管先置于液氮内保存，随后放入-80 ℃冰箱内。

2.5 观察指标

2.5.1 肝功能及肝纤维化指标测定 ELISA法分别检测各组小鼠肝功能指标AST、ALT、TBIL及肝纤维化指标HA、LN、PCⅢ水平，严格按照试剂盒说明书上的操作步骤进行。

2.5.2 肝组织病理学观察 取约1 cm×1 cm×1 cm大小肝组织，生理盐水冲洗后放入40 g/L甲醛液中固定，固定后乙醇梯度脱水，二甲苯透明后浸蜡及包埋，制作病理切片。染色后，光镜下观察各组小鼠肝组织病理形态变化。

2.5.3 qPCR检测 称取100～150 µg的肝组织块，用TRIpure裂解液离心提取RNA，加入等体积的异丙醇，12 000 r/min 4 ℃离心5 min，弃掉上清，超净台干燥沉淀2～5 min，加入RNase-free water溶解沉淀，-80 ℃保存。RNA电泳：称取0.25 g琼脂糖粉，加入25 mL的1×TBE缓冲液，放入微波炉中煮沸30 s，重复4～5次，煮沸结束后加1.5 µL核酸染料，倒入制胶盒内，等待凝固。取4 µL的RNA样本和2 µL的1×Loading buffer 进行混合上样，200 V，10 min。从NCBI上查找小鼠的Shh、Gli1、Gli2、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等基因的mRNA序列，并以相应种属的GAPDH作为内参基因，根据引物设计的原则，用Premier 5.0设计目标基因和内参基因的特异性引物，由上海博尚生物工程技术有限公司进行合成，见表1。用2-ΔΔCt进行进一步定量分析。

表1 引物序列

2.5.4 Western blot检测小鼠肝组织中Gli1、Gli2、Shh、α-SMA蛋白表达量 称取100～150 µg的组织块，放入含有磁珠的2 mL研磨管中。每管加1 mL的含PMSF的RIPA裂解液（RIPA裂解液：PMSF＝1 000∶1）置于研磨机粉碎。离心后取上清液，BCA法进行蛋白浓度测定，记录数据。取等量蛋白（10 µg）进行10% SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后，室温孵育2 h，用一抗、二抗稀释液稀释一抗到工作浓度，将膜置于一抗溶液中，置摇床室温孵育2 h。将膜置于TBST中，漂洗3次，10 min/次。根据一抗来源选择合适的二抗，用一抗、二抗稀释液稀释HRP标记的二抗到工作浓度（1∶5 000），室温孵育2 h。TBST洗膜（10 min×3次），显影并分析。

2.6 统计学方法 用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计处理。计量资料服从正态分布用（）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 6组小鼠一般状态 在实验前，各组小鼠精神状态好，活动能力强，毛色有光泽。随着天数的推移，模型组小鼠出现形体消瘦，皮毛紊乱欠光泽，活动减少，反应迟缓，摄食量减少。至实验结束时，正常组毛色光泽、饮食如常、活泼好动、体型正常；模型组小鼠明显出现食欲减退，形体瘦弱，体质量减轻，毛色暗，毛发紊乱无光泽，精神萎靡，呈现疾病状态；西药组、祛湿组、通络组、祛湿通络组小鼠的活动频率、皮毛光泽度较模型组有不同程度的好转，摄食一般。

3.2 6组小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ水平变化 见表2。

表2 6组小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ指标检测结果（）

表2 6组小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ指标检测结果（）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与西药组比较，3） P＜0.05；与祛湿组比较，4） P＜0.05；与通络组比较，5） P＜0.05。

组别正常组模型组西药组祛湿组通络组祛湿通络组PCⅢ/（ng/mL）3.80±0.20 20.00±2.401）11.40±0.902）7.70±0.302）3）8.30±0.502）3）5.50±0.302）3）4）5）n 10 10 10 10 10 10 ALT/（U/L）35.90±2.20 110.40±13.601）65.40±4.302）68.80±6.502）71.50±4.202）48.10±2.802）3）4）5）AST/（U/L）71.10±3.40 159.50±9.101）112.50±11.002）116.60±11.402）109.90±10.502）84.50±2.702）3）4）5）TBIL/（µmol/L）7.60±0.50 37.00±2.401）22.20±1.102）14.60±0.702）3）15.70±0.802）3）12.60±0.502）3）4）5）HA/（U/L）237.00±6.60 550.90±4.601）426.60±16.102）326.30±13.402）3）330.50±22.102）3）289.70±11.002）3）LN/（µg/mL）7.30±1.00 94.40±6.401）58.70±5.402）34.70±4.102）3）26.50±0.902）3）17.40±1.202）3）4）5）

3.3 6组小鼠肝脏病理形态变化比较 通过HE和Masson染色进行观察，正常组肝组织结构清晰，肝小叶完整，细胞形态正常，肝细胞索排列整齐，无炎症，无纤维化。肝纤维化模型组小鼠肝组织正常结构破坏严重，有肝细胞脂肪样变、淋巴细胞浸润和肝细胞水肿，点灶状坏死，肝纤维增生。西药组肝纤维化情况有所好转，细胞水肿、排列较紊乱，肝细胞坏死减少，脂肪空泡减少，炎症减轻，少量纤维组织增生。病理染色发现，与模型组相比，祛湿组、通络组和祛湿通络组肝纤维化的现象均有所好转，纤维增生减少，肝细胞坏死程度减轻，脂肪空泡减少，炎症细胞浸润减少，其中祛湿通络组脂肪变、水肿、肝细胞坏死和纤维增生较模型组明显减少。见图1。

图1 6组小鼠肝组织病理形态变化图（HE、×100；Masson、×100）

3.4 6组小鼠肝组织中Shh、Gli1、Gli2、α-SMA mRNA相对表达量比较 见表3。

表3 6组小鼠Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA相对表达水平比较（）

表3 6组小鼠Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA相对表达水平比较（）

注：与正常组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与西药组比较，3） P＜0.05；与祛湿组比较，4） P＜0.05；与通络组比较，5） P＜0.05。

组别正常组模型组西药组祛湿组通络组祛湿通络组α-SMA 1.04±0.03 2.03±0.031）1.71±0.022）1.48±0.022）3）1.48±0.012）3）1.28±0.012）3）4）5）n 10 10 10 10 10 10 Gli1 1.11±0.03 1.99±0.021）1.78±0.032）1.51±0.022）3）1.51±0.052）3）1.25±0.022）3）4）5）Gli2 1.06±0.04 2.01±0.041）1.73±0.022）1.50±0.022）3）1.53±0.032）3）1.27±0.022）3）4）5）Shh 1.02±0.03 1.94±0.031）1.76±0.022）1.54±0.022）3）1.53±0.032）3）1.29±0.022）3）4）5）

3.5 6组小鼠肝组织中Shh、Gli1、Gli2、α-SMA蛋白表达量比较 见图2。

图2 6组小鼠肝组织Gli1、Gli2、Shh、α-SMA蛋白表达量比较

4 讨 论

茵陈蒿汤出自汉张仲景《伤寒论》，是治疗肝胆湿热的主方；三甲散乃明末瘟疫学家吴又可治疗伏气“主客交病”之主方，薛氏三甲散出自薛生白《湿热病篇》，在吴氏三甲散基础上演变而来，针对湿热证后期，主客交混，络脉凝瘀特点而创立的名方。本研究自拟茵陈三甲散是基于祛湿通络立法，以茵陈蒿汤和薛氏三甲散合方而成。全方用药，清热祛湿、通络化瘀，切中NAFLD肝纤维化主要病机。本实验结果可见，祛湿通络组在与除正常组外各组小鼠进行两两比较中肝功能指标水平和肝纤维化指标水平，以及Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的mRNA表达水平及蛋白表达量均显著降低（P＜0.05），表明自拟茵陈三甲散在减少肝脏损伤，降低肝纤维化方面最为明显。肝组织病理变化也说明，通过HE和Masson染色观察到祛湿通络组小鼠肝细胞脂肪变、水肿、肝细胞坏死和纤维组织增生较西药组、祛湿组和通络组均减轻（P＜0.05），以上结果均证实自拟茵陈三甲散在减轻肝纤维化的程度上效果优于秋水仙碱、茵陈蒿汤和薛氏三甲散。

肝纤维化发病机制复杂，主要病理改变为当肝脏受到炎症损伤时，肝内弥漫性细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度沉积［7］，而肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）已被证实是ECM的主要来源，HSCs激活并转化为肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）是发展为肝纤维化的中心环节［8］，因此抗肝纤维化是各种慢性肝病预后、转归的关键所在。研究表明，Hh信号通路与非酒精性脂肪性肝炎关系密切，且能够激活HSCs，导致肝纤维化的发生［9］，过度激活甚至可发展为肝硬化和肝癌［10］。Hh信号通路主要由Hh配体、受体（patched、smoothened）和转录因子Gli1、Gli2和Gli3及其下游靶基因组成［11］。Gli是Hh信号通路末端的最终转录效应因子，主要作用是促使HSCs转换为肌成纤维细胞。α-SMA是肝纤维化活化的重要标志物。Hh信号通路在肝脏中高度保守，在调节肝组织的生长、分化、模式化和血管化等方面发挥着重要作用。本研究显示，在给予茵陈三甲散灌胃的小鼠肝脏组织内Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA和蛋白表达量上均低于除正常组外的其他组。提示基于祛湿通络立法的茵陈三甲散对小鼠肝纤维化的抑制作用优于单用茵陈蒿汤或薛氏三甲散，其作用机制可能与下调和抑制Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的表达，阻止肝星状细胞活化有关，从而阻断Hh信号通路的激活。说明祛湿通络法对MCD饲料诱导肝纤维化小鼠具有较好的保护作用，其作用优于单用祛湿法或通络法。

综上，祛湿法或通络法对改善MCD饲料诱导的小鼠NAFLD肝纤维化均有效，但祛湿通络法综合效果最佳，其作用机制与下调Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的表达，从而抑制Hedgehog信号通路的活化有关。