从lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1信号通路探讨透骨消痛胶囊改善膝骨关节炎内质网应激研究

付长龙，梅阳阳，谢新宇，涂海水，叶锦霞，郑春松，马德尊*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建卫生职业技术学院，福建 福州 350101）

关节软骨退行性变是膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的主要病理特点［1-2］。关节软骨发生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可显著加剧KOA病情［3］，其中跨膜蛋白肌醇激酶1α（IRE1α）/X盒结合蛋白1（XBP1）途径是导致KOA关节软骨发生ERS的关键环节［4-5］。有研究发现，KOA关节软骨发生ERS与长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的调控密切相关，尤其lncRNA NEAT1功能的发挥将影响KOA病理进程［6］。

KOA的核心病机是“本痿标痹”，因此对KOA的治则宜行补肝肾祛风湿之法［7］。透骨消痛胶囊（由巴戟天、白芍、川芎、肿节风组成）作为福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂，具有补肾柔肝、活血祛风的功效，临床治疗KOA疗效显著［8］。但lncRNA NEAT1与IRE1α/XBP1的调控关系在KOA的作用及透骨消痛胶囊的效用机制仍需进一步探讨。

1 材 料

1.1 实验动物与药物 8周雄性C57BL/6小鼠（SPF级）48只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005；实验动物予以分笼饲养，自由饮水，标准饲料喂养饲养于福建中医药大学实验动物中心，使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007，实验过程及方法均符合福建中医药大学实验动物伦理委员会要求（伦理审批号FJTCMIACUC-2022120）。透骨消痛胶囊（闽药制备字Z20190010000，福建中医药大学附属第二人民医院，生产批号：202205005）；牛磺熊去氧胆酸（意大利贝斯迪大药厂，批号：1918）。

1.2 实验试剂 XBP1、ER伴侣蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、GAPDH（美国SAB公司，批号：9N29，9N29，4612，9306）；IRE1α（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：00101005）；Superkine超敏型ECL发光液（Abbkine生物公司，批号：ATVAP 2501）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：027E2201 CA）；lncRNA NEAT1（Forward：GCAGGTGGCACTA CTTTGAG；Reverse：GTGACAACCATCTATTGAGCA ACT）、GAPDH（Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCA CAG，Reverse：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC）引物均由福州尚亚生物技术有限公司进行合成。

1.3 实验仪器 微量紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；全自动酶标仪（美国BIO-TEK公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 动物分组、造模与干预 48只小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白组12只、造模组36只。造模组动物经5%异氟醚吸入麻醉后，采用Hulth法诱导KOA模型［9］，待KOA模型建立后，再用随机数字表法随机分为模型组12只、对照组12只、透骨消痛胶囊组12只。对照组予以牛磺熊去氧胆酸500 mg/kg进行灌胃［10］；透骨消痛胶囊组选择透骨消痛胶囊临床等效剂量368 mg/kg进行灌胃［11］；空白组和模型组给予等量生理盐水灌服，灌胃剂量依据小鼠体质量按周计算调整，4组均连续灌注胃4周。

2.2 组织取材与处理 于末次灌胃结束后，经5%异氟醚吸入麻醉后处死。收集其余小鼠膝关节软骨组织，置于液氮中转移至-80 ℃冰箱冷冻保存。

2.3 观察指标

2.3.1 软骨组织病理改变 将待测小鼠膝关节固定于小动物Micro-CT的检查槽中，开始扫描，设置的条件为：电压60 kV，电流666 µA，分辨率为50 µm，扫描时间为30 min，获得不同断面的图片，经图像二值化，对膝关节的扫描图片进行三维图像重构。

2.3.2 软骨组织中相关蛋白表达情况 提取各组软骨组织总蛋白，BCA进行蛋白定量，配制12%分离胶和5%浓缩胶，上样后进行电泳，后经转膜（半干式），封闭2 h后洗膜，再将各条膜放入预先配置好的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP的一抗后置于4 ℃冰箱摇床过夜进行充分震荡反应，待二抗反应处理后，使用ECL发光液进行显影，于凝胶成像仪下进行曝光成像，后分析储存。

2.3.3 软骨组织lncRNA NEAT1表达情况 按Trizol操作说明提取软骨中总RNA，逆转录为cDNA，根据试剂盒进行检测。

2.4 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料符合正态分布，数据采用（）表示，多组间比较采用方差分析，若方差齐，多组间两两比较采用LSD-t法；若方差不齐，多组间两两比较则采用Games-Howell法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 实验动物情况 本次实验过程入组动物无出现意外死亡。

3.2 软骨组织影像学改变情况 拍摄Micro-CT观察膝关节的形态变化，结果显示与空白组比较，模型组半月板结构缺失，胫骨平台软骨面欠光滑，呈现凹凸不平状，并伴有明显的骨赘增生；对照组、透骨消痛胶囊组小鼠内侧半月板结构缺失，与模型组比较，其关节软骨退变程度明显减轻。见图1。

图1 膝骨关节炎模型Micro-CT鉴定结果

3.3 软骨组织中相关蛋白表达量比较 Western blot结果显示，与空白组比较，模型组的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，透骨消痛胶囊组与对照组的IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。见表1、图2。

表1 4组软骨组织中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表达量情况（）

表1 4组软骨组织中IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白表达量情况（）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

CHOP/GADPH 0.49±0.09 1.09±0.041）0.77±0.121）2）0.91±0.091）2）组别空白组模型组对照组透骨消痛胶囊组IRE1α/GADPH 0.54±0.06 1.06±0.011）0.76±0.031）2）0.83±0.021）2）XBP1/GADPH 0.49±0.01 1.21±0.011）0.83±0.071）2）0.94±0.041）2）GRP78/GADPH 0.50±0.04 1.07±0.051）0.74±0.011）2）0.87±0.011）2）

图2 4组小鼠关节软骨中相关蛋白条带图

3.4 小鼠关节软骨组织中lncRNA NEAT1表达水平比较 qPCR结果显示，与空白组比较，模型组关节软骨组织中lncRNA NEAT1表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，透骨消痛胶囊与对照组中lncRNA NEAT1表达水平明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 小鼠关节软骨组织中lncRNA NEAT1水平比较（）

表2 小鼠关节软骨组织中lncRNA NEAT1水平比较（）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

lncRNA NEAT1 1.00±0.00 3.21±0.321）2.34±0.162）2.09±0.182）组别空白组模型组对照组透骨消痛胶囊组

4 讨 论

研究证实，内质网应激可加剧OA软骨退变［12］。ERS发生时，未折叠蛋白的异常堆积可促使GRP78从膜蛋白上解离，与结合未折叠蛋白结合，而IRE1α发生磷酸化后，可剪接并激活转录因子XBP1，XBP1的持续活化又可上调CHOP基因表达，而后者又可促使半胱天冬酶3（Caspase-3）表达，最终导致软骨细胞凋亡［13-14］。此外，GRP78也是XBP1靶点，受XBP1激活后发挥调控ERS作用［15-16］。牛磺熊去氧胆酸作为一种ERS抑制剂，本研究结果亦证实，其可抑制KOA软骨的内质网应激，改善软骨退变程度。

lncRNA NEAT1作为一种与KOA发生、发展密切相关的非编码长链RNA，在调控软骨细胞内质网应激方面充当了重要的角色［17］。研究表明，在KOA软骨和软骨细胞中，lncRNA NEAT1含量表达显著增高［18］；有研究证实，过表达lncRNA NEAT1可显著上调与内质网应激密切相关蛋白的XBP-1S/XBP-1U比值与GRP78表达［19］。而NEAT1下调可抑制内质网应激调控的细胞凋亡［20］。本研究结果显示，在KOA模型小鼠软骨组织中，lncRNA NEAT1基因水平较空白组显著升高，IRE1α、XBP1、GRP78、CHOP蛋白含量显著升高，而经透骨消痛胶囊干预后，小鼠软骨组织中上述指标表达呈显著下降趋势，进而可以有效延缓KOA小鼠软骨退变，这亦与本研究Micro-CT结果相一致。

综上，本研究结果表明，透骨消痛胶囊可以有效延缓KOA小鼠软骨退变，其机制与下调KOA小鼠软骨组织中lncRNA NEAT1水平及IRE1α/XBP1信号通路相关蛋白含量表达，进而缓解ERS密切有关。同时，本研究仍存在一定的局限性，即透骨消痛胶囊与lncRNA NEAT1和IRE1α/XBP1的内在靶向调控机制尚需进一步探讨。