卵清蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

李妮，朱文勇，宋绍辉，马磊，高菁霞，廖国阳，李卫东

中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，云南昆明650118

季节性流感每年在全球造成300 万～500 万人患严重呼吸道疾病，29万～65万例死亡［1］，控制和预防流感病毒感染十分重要［2］，而接种疫苗是最有效的预防方法［3］。目前，季节性流感疫苗主要有三价和四价流感疫苗［4］，大多采用鸡胚进行生产，疫苗成品中含有一定量鸡胚来源的杂蛋白。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）是鸡胚中含量最高的蛋白，具有强过敏原性。每年接种流感疫苗可能导致对OVA的免疫从而增加不良反应，降低疫苗的耐受性［5］。长期以来，鸡蛋过敏人群禁止接种流感疫苗，但最近的一项研究表明［6］，大多数鸡蛋过敏的患者可以安全接种OVA含量低的疫苗。《中国药典》三部（2015版）规定，流感病毒裂解疫苗中OVA含量应不高于500 ng／mL［7］。

以往对OVA 进行定量检测常采用反向被动血凝反应（reversed passive hemagglutination，RPHA）［8］、单向免疫扩散（single-redial immunodiffusion，SRID）、常规免疫电泳［9］以及对流免疫电泳法［10］，这些方法操作繁琐且耗时长，误差较大，灵敏度低，不能准确定量。与上述方法相比，德国OVA定量检测试剂盒Serazym®Ovalbumin 操作简便，灵敏度高，可快速准确定量，也是国内外鸡胚流感疫苗生产中广泛使用的检测方法，但该进口试剂盒价格高昂，检测成本高，不适宜大规模推广，因此，建立一种精确、简便、高效、低成本及高灵敏度的检测方法对于流感疫苗中OVA的定量检测至关重要。本研究以兔抗OVA多克隆抗体作为包被抗体，建立双抗体夹心ELISA 检测法，并进行优化及验证，以用于鸡胚流感疫苗中残留OVA的检测。

1 材料与方法

1.1OVA 参考品原料 鸡OVA 参考品原料（纯度≥98%）购自美国Sigma公司（货号：A5503-1G），溶解稀释后用德国SERAMUN 公司酶联卵清蛋白检测试剂盒Serazym®Ovalbumin标定浓度后分装冻存。

1.2病毒液、细胞上清液、抗原、疫苗及蛋清 HAV病毒液、Vero 细胞上清液、Vero 细胞培养流感H3N2 病毒液、肺炎支原体抗原、鸡蛋蛋清、鸭蛋蛋清、鹌鹑蛋蛋清、鸡胚培养流感H3N2单价原液、鸡胚培养H3N2尿囊液、流感病毒裂解疫苗半成品、Vero细胞培养流感H1N1病毒液和SARS-CoV-2灭活病毒液均由本所提供。

1.3主要仪器及试剂 兔抗OVA 多克隆抗体和HRP标记的兔抗OVA 多克隆抗体购自美国Thermo 公司（货号：PA1-196；PA1-196-HRP）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、OVA干粉和TMB单组分显色液均购自北京索莱宝生物科技有限公司；酪蛋白、氨基吡啉、proclin 300、甘油、蔗糖、氯化钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、氯化钠、十二水和磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠均购自国药集团化学试剂有限公司；鸡OVA 标准品分别购自美国Sigma 公司和中国Solarbio 公司；Tween-20购自美国Sigma公司；新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；2%脱脂奶粉、0.01 mol／L PBS 和98%浓硫酸均由本所提供；Serazym®Ovalbumin OVA 定量检测试剂盒购自德国SERAMUN 诊断试剂有限公司；96 孔酶标板购自美国Corning 公司；酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.4OVA 定量参考品的制备 采用称重法将OVA

参考品原料配制成1µg／mL的储液，用OVA定量检测试剂盒对该参考品浓度进行验证后再分别稀释至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313 ng／mL。

1.5双抗体夹心ELISA检测方法的建立 将兔抗OVA多克隆抗体用包被缓冲液（0.01 mol／L PBS，pH 7.2）稀释，按1µg／mL浓度包被酶标板，100µL／孔，4 ℃过夜；PBST洗板3次，加入封闭液，250µL／孔，37 ℃孵育2 h；PBST洗板3次，加入稀释至20 ng／mL的OVA标准品抗原、阴性对照（0.01 mol／L PBS）以及待检样品，100µL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入HRP标记的兔抗OVA 多克隆抗体（用酶标抗体稀释液稀释），100µL／孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗板5次，加入TMB，100µL／孔，37 ℃避光显色15 min；加入2 mol／L硫酸终止反应，50µL／孔，用酶标仪测定A450值。

1.6方法的优化

1.6.1包被抗体及酶标抗体浓度的确定 采用棋盘滴定法。将兔抗OVA 多克隆抗体用包被缓冲液稀释至2、1、0.5、0.25µg／mL，加入酶标板，4 ℃包被过夜；PBST 洗板3次，用1%BSA 于37 ℃封闭2 h；PBST洗板3次，加入20 ng／mL OVA标准品作为阳性对照，0.01 mol／L PBS作为阴性对照，37 ℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入HRP标记的兔抗OVA多克隆抗体（用酶标抗体稀释液稀释至浓度为0.5、0.25、0.125µg／mL），37 ℃孵育1 h；其余步骤同1.5 项。选择阳性对照检测值（P）与阴性对照检测值（N）的比值（P／N）最大时对应的抗体浓度作为最适工作浓度。

1.6.2封闭液的确定 包被抗体及酶标抗体均采用1.6.1项确定的最适浓度，于4 ℃包被过夜；分别用不同封闭液（PBS稀释的1%BSA、2%BSA，1%BSA+1%蔗糖，2%BSA+2%蔗糖，以未封闭为对照）于37 ℃封闭2 h，每种条件设置2个重复。以20 ng／mL OVA标准品作为阳性对照，0.01 mol／L PBS作为阴性对照，选择P／N最大时对应的封闭液配方作为最适封闭液。

1.6.3判断标准的确定 采用优化后体系检测0.01mol／L PBS（11 份）、2%脱脂奶粉（5 份）、Vero 细胞上清液（5份）、1%BSA（5份）、Vero细胞培养流感H3N2病毒液（10 份）、Vero 细胞培养流感H1N1 病毒液（10 份）和新生牛血清（5 份）共51 份阴性样本，在要求99%（单侧）可信度条件下，以吸光度均值+3SD作为阳性判断值［11］，计算Cut-off值，作为阴阳性样本的判断标准。

1.7方法的验证

1.7.1标准曲线线性范围及检测下限的确定 将OVA标准品分别稀释为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010 ng／mL，采用优化的方法进行检测，每个浓度设3 个重复，试验重复5 次。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程并计算相关系数（R2），验证标准曲线的线性范围。根据1.6.3 项确定的Cut-off值判断该体系的检测下限。

1.7.2特异性 用建立的方法分别对8 份阴性样本（HAV 病毒液、Vero 细胞上清液、Vero 细胞培养流感病毒液、SARS-CoV-2 病毒液、肺炎支原体抗原、脱脂奶粉、0.01 mol／L PBS、2%BSA）和8份阳性样本［鸡蛋蛋清、鸭蛋蛋清、鹌鹑蛋蛋清、鸡胚培养流感病毒H3N2 单价原液、鸡胚培养流感病毒H3N2 尿囊收获液、Sigma鸡OVA标准品、Solarbio鸡OVA标准品、SERAMUN 试剂盒OVA 标准品（20 ng／mL）］进行检测，根据1.6.3项确定的Cut-off值验证该方法的特异性。

1.7.3重复性

1.7.3.1板内重复性 随机选取阴性和阳性样本各5 份，并设空白对照组和阴性对照组（PBS），每份样本设3个重复，于同一块酶标板上采用优化后的方法进行检测，计算同一份样本检测结果的板内变异系数（CV），验证该方法的板内重复性。

1.7.3.2板间重复性 取3块酶标板，采用优化后的方法对1.7.3.1项中的样本进行检测，计算同一份样本检测结果的板间CV，验证该方法的板间重复性。

1.7.4准确度 随机选取4个批次的流感病毒裂解疫苗半成品，分别采用优化后的方法和SERAMUN OVA定量检测试剂盒进行检测，比较建立的方法与试剂盒检测结果的符合率，评价建立的方法检测样本的准确度。

1.8数据采集与分析 采用GraphPad prism 8.0软件分析数据并作图。

2 结果

2.1参考品浓度标定 用德国SERAMUN 公司OVA定量检测试剂盒标定配制的参考品浓度为（876 ±26）ng／mL，与德国SERAMUN 公司试剂盒符合率为85%～90.2%。

2.2方法的优化

2.2.1最适包被抗体和酶标抗体浓度 包被抗体浓度为1µg／mL，酶标抗体浓度为0.25µg／mL时，P／N值最大，为81.943，见表1。因此选择包被抗体及酶标抗体最适工作浓度分别为1和0.25µg／mL。

表1 包被抗体和酶标抗体工作浓度优化结果Tab.1 Optimization of working concentration for coating and enzyme-labeled antibody

2.2.2最适封闭液 以2% BSA+2%蔗糖作为封闭液时，P／N 值较大，为94.409，见表2。因此选择2%BSA+2%蔗糖作为最适封闭液配方。

表2 封闭液优化结果Tab.2 Optimization of blocking reagent

2.2.3判断标准的确定 51 份阴性样本检测结果平均值为0.032 67，标准差为0.006 33，经计算，Cut-off值为0.051 66。因此，检测结果＞0.052时判为阳性，≤0.052则判为阴性。

2.3方法的验证

2.3.1标准曲线线性范围及检测下限 5 次试验绘制的标准曲线表明，OVA 浓度在5 ～0.313 ng／mL范围内，A450值与样品浓度呈良好的线性关系，且R2均大于0.97，重复性好，各浓度标准品检测结果的变异系数（CV）均小于6%，见表3，标准曲线见图1。检测下限为0.078 ng／mL。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve

表3 5次标准曲线检测结果（ng／mL）Tab.3 Results of standard curves in 5 tests（ng／mL）

2.3.2特异性采用优化的方法检出鸡蛋蛋清、鸭蛋蛋清、鹌鹑蛋蛋清、鸡胚培养流感病毒H3N2 单价原液、鸡胚培养流感病毒H3N2 尿囊收获液、Sigma 鸡OVA 标准品、Solarbio 鸡OVA 标准品、SERAMUN 试剂盒OVA 标准品（20 ng／mL）阳性样本8 份，其余样本检测结果均为阴性，与已知背景相符。表明该方法特异性较好。

2.3.3重复性 用优化后的方法检测阴性和阳性样本各5份的板内CV在2.562%～13.887%之间，板间CV在4.000%～16.497%之间，见表4。表明该方法重复性较好。

表4 重复性验证结果（ng／mL）Tab.4 Verification for repeatability（ng／mL）

2.3.4准确度 建立的方法与SERAMUN OVA 定量检测试剂盒检测4 个批次流感病毒裂解疫苗半成品结果的符合率在93.79% ～107.05%之间，见表5。表明该方法具有较高的准确度。

表5 准确度验证结果Tab.5 Verification for accuracy

3 讨论

流感仍是全球主要的公共卫生问题。WHO估计，每年季节性流感导致的呼吸道疾病可致290 000 ～650 000 人死亡［12］。接种疫苗仍是预防流感的最佳手段。大多数国家目前仍以接种流感亚单位疫苗和裂解灭活病毒疫苗为主［13］，而多数流感疫苗采用鸡胚生产，疫苗中OVA 的存在可导致严重过敏，因此，有效降低OVA 含量对于疫苗生产至关重要［14］。研究表明，OVA可导致炎症细胞侵入呼吸道，引起雌性BALB／c 小鼠脂质过氧化从而导致DNA 损伤［15］，以及诱导细胞完整性损伤导致细胞功能障碍［16］。因此，降低流感疫苗中的OVA 含量对于提高疫苗的耐受性至关重要。

由于蛋白质不能像核酸一样通过PCR进行扩增，蛋白质准确定量一直面临挑战［17］，而传统检测OVA的方法操作复杂且灵敏度低，不适于疫苗中OVA 定量检测。因此，本研究建立了一种双抗体夹心ELISA方法快速对OVA 进行定量检测，与间接ELISA 方法相比，双抗体夹心ELISA 方法减少了孵育及洗涤次数，可减少操作时间，增加样品检出率，另外，直接将HRP标记兔抗OVA多克隆抗体，避免了抗抗体结合的非特异性；与竞争ELISA方法相比，双抗体夹心ELISA方法结果判读更直观，且检测灵敏度更高。因此，本研究以兔抗OVA 多克隆抗体作为包被抗体，利用ELISA 方法抗原抗体特异性结合的原理建立双抗体夹心法对OVA 进行定量检测。以德国SERAMUN 试剂盒为标准标定参考品主要是由于目前并无国际统一或指定的标准或检测试剂盒来精确定量OVA 含量，而本实验中使用的试剂盒在国内外均被广泛应用，以其作为标准可保持监测数据与往年的延续［18］。以购自美国Sigma 公司的OVA 作为参考品原料，采用称重法配制的参考品经进口试剂盒标定后浓度基本相符，可采用该方法制备参考品，且操作简便，通用性强。本研究建立的方法特异性强，重复性好，检测灵敏度高，且操作简便，与进口试剂盒相比，准确度不低于进口试剂盒，且极大地降低了成本。多次重复试验证明，该方法的线性范围稳定且重复性好，在5 ～0.313 ng／mL范围内可对样品进行准确定量，有望在鸡胚流感疫苗生产中用于OVA含量测定。

随着对纳米材料研究的深入，金纳米颗粒在辅助免疫PCR 开发诊断试剂，如检测试纸等［19-20］，以及在ELISA 检测包括骨桥蛋白［21］、克罗诺杆菌［22］、莱克多巴胺［23］等生物标志物和作为增强剂辅助PCR［24］等方面均发挥着重要作用，并可显著提高反应效率及增强检测分析的灵敏度和特异性，引入金纳米颗粒或可开发出灵敏度和特异性更高的OVA定量检测方法。