清热消瘕方延缓糖尿病肾脏病大鼠肾损伤作用机制

吴巧茹,王耀献,王奕萱,张佳乐,张 超,3,周少峰,郑慧娟,3,崔赵丽,孙卫卫

(1.北京中医药大学东直门医院,北京 100700;2. 北京中医药大学,北京 100029;3. 北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室,北京 100700)

糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病主要的微血管病变之一,也是动脉粥样硬化性心血管疾病的相关风险因素［1］。目前,DKD的治疗措施主要包括控制体重、血糖、血压,使用肾素-血管紧张素系统抑制剂等,但这些传统方法并不总能产生满意疗效,如何延缓DKD的进展一直是国内外医学界的研究热点和难点。中医药干预DKD有特色疗效,可部分逆转早期微量白蛋白尿。上世纪90年代国医大师吕仁和教授针对DKD提出了“肾络癥瘕”病机理论,王耀献教授对此理论进行了继承和发展,强调了热邪在“肾络癥瘕”发展中的重要性,并提出DKD的基本病机为“内热致癥”［2］。王耀献教授根据多年临床经验,总结出清热消瘕方用于干预DKD早期的“瘕”阶段,收获良好临床疗效。本研究以DKD大鼠为研究对象,探讨清热消瘕方延缓DKD肾损伤的潜在机制,以期进一步阐释“肾络癥瘕”病机理论的科学内涵。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠24只,6～8周龄,体重(200±30 )g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2016-0011。大鼠饲养于北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室动物实验中心,均自由摄食并饮用纯净水,饲养环境温度恒定(24±2)℃,相对湿度60%～65%,12/12 h照明黑暗循环进行,室内通风良好。实验过程符合北京中医药大学关于实验动物管理条例,并经过北京中医药大学伦理审批(伦理编号:BUCM-4-2021041304-2076)。

1.2药物与试剂 清热消瘕方颗粒(主要组成为生黄芪、生地、丹参、黄连、三七、降香)由北京康仁堂有限公司提供,缬沙坦胶囊(天大药业珠海有限公司,国药准字H20030777,规格:80 mg/粒)由北京中医药大学东直门医院药剂科提供。糖原PAS染色液(Solarbio,货号:G1281),改良Masson三色染色液(Solarbio,货号:G1346),抗谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)抗体(abcam,货号:ab125066),抗溶质载体家族7成员11(SLC7A11,又称xCT)抗体(abcam,货号:ab175186),兔二步法免疫组化检测试剂盒(中杉金桥,货号:PV-9001),DAB显色试剂盒(中杉金桥,货号:ZLI-9018)。

1.3分组、造模及干预方法 大鼠适应性喂养7 d后,随机分为假手术组、模型组、清热消瘕方组和缬沙坦组,每组6只。各组大鼠过夜禁食12 h以上,以1%戊巴比妥钠(40～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后,对大鼠背部备皮,常规碘伏消毒,在左侧肋骨下缘2 cm,距背部中线1 cm处纵向依次剪开皮肤和肌肉层,切口约1 cm,模型组、清热消瘕方组和缬沙坦组充分暴露左肾,剥离左肾包膜,肾蒂部结扎后切除左肾,洁净棉球吸干腹腔积液后关腹,逐层缝合切口(每隔0.5 cm左右一针,每针打手术结4次);假手术组开腹后直接关腹。皮层缝合完毕后使用湿润碘伏棉球擦干血迹防止啃咬。术后1周,待所有大鼠术口完全愈合,禁食12 h以上,模型组、清热消瘕方组和缬沙坦组大鼠单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ) 50 mg/kg(STZ临用前溶解于0.1 mol/L、pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液,现用现配,低温,避光,20 min内使用),假手术组大鼠腹腔注射等体积上述缓冲液。连续3 d尾尖采血测随机血糖,高于16.7 mmol/L视为造模成功。若血糖未达标,1周后复测血糖,仍不达标再次予STZ 50 mg/kg腹腔注射。造模成功后第2天起,清热消瘕方组给予清热消瘕方颗粒剂10.2 g/(kg·d)灌胃,缬沙坦组给予缬沙坦8 mg/(kg·d)灌胃,假手术组及模型组给予等量蒸馏水灌胃,灌胃剂量根据体表面积折算,每公斤体重约为人临床用量的6.3倍,各组均连续灌胃16周。

1.4取材方法 灌胃16周后,代谢笼收集大鼠24 h尿液样本,以4 ℃ 3 000 r/min离心10 min,收集上层样本分装,-80 ℃冰箱冻存备用。大鼠过夜禁食12 h以上,称重后腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉取血,分别装于含有促凝剂和EDTAK3的采血管中,以4 ℃ 3 000 r/min离心10 min,收集上层血清分装,-80 ℃冰箱冻存备用。完整剪下右侧肾脏,剥离包膜,称重。分离肾皮质,部分迅速放入冻存管投入液氮中,转移至-80 ℃冰箱保存;剩余部分加入4%多聚甲醛溶液于4 ℃冰箱中固定24 h以上,全自动脱水机脱水后进行石蜡包埋,切成4 μm厚度切片备用。

1.5检测指标及方法

1.5.1一般情况 每周测量大鼠体重,观察记录各组大鼠精神状态、活动情况、毛色、饮食饮水情况、尿量等。

1.5.2体重及肾重体重比 比较各组大鼠灌胃16周后体重及肾重体重比［肾重(mg)/体重(g)］。

1.5.3肾功能指标、血糖及血脂指标 24 h尿蛋白总量、血尿素氮、血肌酐、血糖及血清总胆固醇、三酰甘油水平均由北京中医药大学东直门医院检验科使用全自动生化分析仪(Beckman Coulter AU5800)进行检测。

1.5.4肾脏组织病理形态

1.5.4.1HE染色 ①石蜡切片常规脱蜡至水:60 ℃烤片1 h,二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别脱蜡10 min,100%,100%,95%,90%,80%,70%梯度乙醇水化各3 min,自来水洗5 min;②苏木素染核10 min,自来水冲洗多余染液,1%盐酸乙醇分化15 s,自来水洗涤返蓝10 min;③伊红染细胞质:1%伊红染液染色15 min,自来水冲洗1 min;④梯度乙醇上行脱水:70%,80%,90%,95%,100%,100%梯度乙醇上行脱水,各1 min;⑤透明、封片:二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分别透明10 min,中性树胶封片。

1.5.4.2PAS染色 ①石蜡切片常规脱蜡至水同前,滴加1%过碘酸溶液反应8～10 min,流水冲洗3 min,蒸馏水浸洗2次,每次3 min;②Schiff染液阴暗处浸染1 h,流水冲洗10 min;③苏木素染核同前;④梯度乙醇上行脱水、透明、封片同前。

1.5.4.3Masson染色 ①石蜡切片常规脱蜡至水同前,60 ℃煤染液浸染1 h,流水冲洗10 min;②天青石蓝染液滴染2～3 min,水洗2次,每次10～15 s;③苏木素染核3 min,自来水冲洗多余染液,盐酸乙醇分化至组织完全变红,水洗终止分化,流水冲洗10 min;④丽春红染液滴染12 min,弱酸溶液冲洗2次,每次10～15 s;⑤磷钼酸溶液处理15～20 min,镜下观察血管周围胶原亮红色褪至淡红色或无色为止;⑥苯胺蓝染液滴染5 min,弱酸溶液洗涤并覆盖静置2 min;⑦梯度乙醇上行脱水、透明、封片同前。使用Image J 1.8.0软件对病理图片进行半定量分析,计算蓝染面积即纤维化面积占比。

1.5.5肾脏组织中GPX4、xCT表达情况 免疫组化染色观察:①石蜡切片常规脱蜡至水同前,PBS浸洗3次,每次5 min;②水浴锅预热柠檬酸盐修复液(pH 6.0)至95 ℃以上,切片浸入修复液修复20 min,自然恢复至室温,PBS浸洗3次,每次5 min;③滴加内源性过氧化物酶阻断剂50 μL,避光孵育20 min,PBS浸洗3次,每次5 min;④擦干组织周围液体,组化笔围绕组织画圈;⑤一抗孵育组织(rabbit anti-GPX4抗体1∶250,rabbit anti-xCT抗体1∶50,稀释浓度根据预实验结果选择),置于湿盒4 ℃过夜;⑥次日,室温放置1 h,PBS浸洗6次,每次5 min;⑦滴加反应增强液100 μL,37 ℃孵育20 min,PBS浸洗3次,每次5 min;⑧滴加二抗孵育组织,37 ℃孵育20 min,PBS浸洗3次,每次5 min;⑨DAB显色,镜下观察并记录显色时间,保证各指标不同组别切片显色时间一致,水洗终止显色;⑩苏木素核染5 s,自来水冲洗多余染液,盐酸乙醇分化15 s,流水冲洗10 min返蓝;梯度乙醇上行脱水、透明、封片同前。使用Image J 1.8.0软件对病理图片进行半定量分析,计算GPX4、xCT阳性表达面积占比。

1.6统计学方法 使用SPSS 23.0统计软件进行数据统计分析。首先检测样本的正态性,计量资料符合正态分布及方差齐性,组间两两比较采用Student’st检验,多组间比较使用单因素方差分析;非正态分布或方差不齐组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验,多组间比较使用Kruskal-WallisH检验。检验水平α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况比较 假手术组大鼠状态良好,活动自如,反应敏捷,毛色光亮;模型组大鼠精神欠佳,活动减少,反应迟缓,明显消瘦,毛色蜡黄且无光泽,饮水、饮食、尿量较假手术组明显增多;与模型组比较,清热消瘕方组及缬沙坦组大鼠整体情况略好。

2.2各组大鼠体重、肾重体重比比较 与假手术组比较,模型组大鼠体重明显降低(P<0.05),肾重体重比明显增高(P<0.05)。与模型组比较,清热消瘕方组大鼠肾重体重比明显降低(P<0.05),体重变化不明显(P>0.05);缬沙坦组大鼠体重明显升高(P<0.05),肾重体重比变化不明显(P>0.05)。 见表1。

表1 假手术组和糖尿病肾脏病各组大鼠体重及肾重体重比比较

2.3各组大鼠肾功能指标比较 与假手术组比较,模型组大鼠24 h尿蛋白总量和血尿素氮水平均明显升高(P均<0.05),血肌酐水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,清热消瘕方组大鼠24 h尿蛋白总量和血尿素氮水平均明显降低(P均<0.05),血肌酐水平明显升高(P<0.05);缬沙坦组大鼠24 h尿蛋白总量明显降低(P<0.05),血肌酐水平明显升高(P<0.05),血尿素氮水平降低但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 假手术组和糖尿病肾脏病各组大鼠肾功能指标比较

2.4各组大鼠糖脂代谢指标比较 模型组、清热消瘕方组和缬沙坦组大鼠在整个实验期间血糖均维持在16.7 mmol/L以上。灌胃16周后,模型组大鼠血糖及血胆固醇、三酰甘油水平均明显高于假手术组(P均<0.05);清热消瘕方组大鼠血胆固醇水平和缬沙坦组大鼠三酰甘油水平均明显低于模型组(P均<0.05),清热消瘕方组和缬沙坦组其余指标与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 假手术组和糖尿病肾脏病各组大鼠糖脂代谢指标比较

2.5各组大鼠肾脏病理形态比较 HE染色:假手术组大鼠肾小球、肾小管结构完整,小管致密;模型组大鼠肾小球体积增大,肾小管上皮细胞广泛空泡变性坏死,小管上皮细胞大面积损伤脱落;与模型组比较,清热消瘕方组、缬沙坦组大鼠肾小球体积稍有恢复,肾小管损伤明显改善。PAS染色:假手术组大鼠肾小球结构完整,无明显系膜基质增生;模型组大鼠肾小球体积增大,系膜区明显增宽、系膜基质广泛增生,肾小球硬化明显;与模型组比较,清热消瘕方组、缬沙坦组大鼠肾小球体积稍有恢复,系膜基质增生明显减少,散发K-W结节形成。Masson染色:假手术组大鼠肾间质未见明显胶原物质沉积,纤维化面积占比为(2.26±1.00)%;模型组大鼠肾间质存在大量胶原物质沉积,纤维化改变明显,纤维化面积占比为(13.23±4.23)%,明显高于假手术组(P<0.05);与模型组比较,清热消瘕方组、缬沙坦组大鼠肾间质纤维化程度有所缓解,纤维化面积占比分别为(5.56±1.13)%和(6.34±1.43)%,均明显低于模型组(P均<0.05)。见图1。

图1 假手术组和糖尿病肾脏病各组大鼠肾脏组织病理形态

2.6各组大鼠肾脏组织中GPX4、xCT阳性表达情况比较 GPX4、xCT在肾小球、肾小管均有表达,肾小管表达更为明显;模型组GPX4、xCT阳性表达较假手术组少,二者阳性表达面积占比均明显低于假手术组(P均<0.05);清热消瘕方组、缬沙坦组GPX4、xCT阳性表达较模型组多,二者阳性表达面积占比均明显高于模型组(P均<0.05)。见图2及表4。

图2 假手术组和糖尿病肾脏病各组大鼠肾脏组织中GPX4、xCT阳性表达情况(免疫组化染色)

表4 假手术组和糖尿病肾脏病各组大鼠肾脏组织中GPX4、xCT阳性表达面积占比比较

3 讨 论

DKD已成为全球终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的主要病因［3］,据报道,2017年全球有6.975亿ESRD患者,其中中国和印度的患者占将近1/3［4］。可见,DKD是一项严峻的公共卫生挑战,并可能造成巨大的社会和经济负担。DKD的发病机制复杂,至今尚未完全阐明。糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、肾素-血管紧张素-醛固酮系统活性增强、氧化应激和炎症反应等均与DKD的发生发展有关［5］。中医药干预DKD有一定疗效,调节糖脂代谢紊乱、抗纤维化、抗氧化等已被证实为中医药治疗DKD的重要机制［6］。

肾纤维化是DKD终末期不可逆的病理改变,王耀献教授指出,肾小球硬化、肾间质纤维化均是肾络癥瘕的客观表现。肾络癥瘕的形成可细化为三态［7］,在“聚散消长态”中,机体正气有所亏损,但尚有抗邪能力,此时痰、瘀、浊、毒等病理产物的形成与消散处于动态变化过程,治疗的得宜决定着疾病的转归。正如DKD早期,机体肾气仍充,邪热未盛,邪气未伤及肾络,此时肾脏处于高滤过、高灌注状态,临床上可见微量白蛋白尿等,若治疗得当,白蛋白尿可以部分甚至完全逆转;若邪热不解,蓄积加重,熏灼肾脏,致肾关开多合少,精微物质从小便漏出,蛋白尿进一步加重。随着病情进展,邪热依附于有形实邪,固定不移,导致肾络癥瘕正式形成,肾脏出现不可逆的损伤。清热消瘕方是针对DKD早期的“瘕”阶段病机特点而设,此期虚实夹杂,既有气阴两虚,又有血热血瘀,兼气郁热郁,治宜益气养阴、凉血化瘀、理气透热散瘕。故用生黄芪益气养阴,生地黄清热凉血、养阴生津,丹参凉血活血、祛瘀通络,黄连清除气分郁热,降香理气化瘀,三七活血散瘀,降香、三七偏温,避免全方过凉克伐脾土而损伤正气。清热消瘕方中多种药物的有效成分已被证实可缓解DKD肾损伤,其中黄芪的重要活性成分黄芪甲苷可通过缓解氧化应激、延缓肾纤维化、抗细胞凋亡和抗炎等延缓DKD的进展［8］;地黄中的地黄多糖能有效减轻STZ诱导的糖尿病小鼠的高血糖、高血脂、微血管炎症和氧化应激状态［9］;丹参中的丹参多酚酸盐可阻断高糖环境下超氧化物的生成,从而抑制足细胞凋亡［10］。

本实验以单侧肾切除术联合STZ单次腹腔注射二联法构建DKD大鼠模型,在整个干预期间大鼠血糖水平均维持在16.7 mmol/L以上,随后的尿蛋白检测及病理观察结果均表明DKD模型构建成功。在缺乏病理学诊断的情况下,持续性蛋白尿是全球公认的DKD主要诊断标准［11］。本实验中,模型组大鼠24 h尿蛋白总量明显高于假手术组,大鼠肾脏肾小球体积增大,系膜区明显增宽、系膜基质广泛增生,肾小管上皮细胞广泛空泡变性坏死,小管上皮细胞大面积损伤脱落,肾间质存在大量胶原物质沉积,纤维化改变明显;清热消瘕方干预可降低24 h尿蛋白总量,可一定程度上缓解上述损伤。值得注意的是,模型组大鼠血尿素氮水平明显高于假手术组,而血肌酐水平明显低于假手术组;清热消瘕方干预可明显降低血尿素氮水平,升高血肌酐水平。肌酐是骨骼肌中磷酸肌酸的唯一代谢产物,与机体骨骼肌总量相关［12］。血肌酐不仅会随着肾小球滤过率的变化而变化,也会随着肌肉总量的变化而变化［13］。有研究发现,低血肌酐水平可以增加2型糖尿病的发病风险［14］,这可能与肌肉含量减少相关的胰岛素抵抗有关［12］。故推测模型组大鼠血肌酐水平降低可能与大鼠体重低、肌肉含量低有关;清热消瘕方干预上调了血肌酐水平,可能与其延缓肌肉总量下降和改善胰岛素抵抗有关。

铁死亡是一种区别于细胞凋亡、坏死、焦亡、自噬等的细胞程序性死亡方式,与铁(Fe2+)介导、活性氧诱导的脂质过氧化密切相关［15］,可能由氧化应激和抗氧化系统之间的失衡驱动［16］。近年越来越多的研究表明,铁死亡可能在糖尿病及其并发症(如DKD、糖尿病心肌病、糖尿病心肌缺血再灌注损伤和动脉粥样硬化等)的发展中发挥重要作用［17］。调控铁死亡可以有效减轻高糖环境中的足细胞损伤［18］,抑制铁死亡可以减轻肾间质纤维化和炎症细胞聚集［19］,铁死亡可能是DKD治疗的新方向。system xc-谷胱甘肽-GPX4轴是铁死亡的关键调控通路,Kim等［20］研究发现,糖尿病患者的肾活检标本中GPX4和xCT的mRNA表达水平下降。本实验中,模型组大鼠肾组织中GPX4、xCT阳性表达较假手术组少,清热消瘕方干预可上调GPX4、xCT表达,提示清热消瘕方可能通过调控铁死亡延缓DKD的进展。

综上所述,“肾络癥瘕”病机指导下的清热消瘕方可有效缓解DKD肾损伤和上调肾脏中GPX4、xCT表达,该方可能通过调控铁死亡延缓DKD的进展,其确切机制及相关靶点仍需进一步体内外实验以验证。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。