基于凝胶渗透色谱法的枸杞多糖含量测定*

黄春花

（四川卫生康复职业学院 教育与体育学院，四川 自贡 643000）

0 引 言

枸杞作为我国目前最常使用的一种名贵中药材，具有清热、名目等功效。在枸杞中，最主要的活性成分为枸杞多糖。因此，对枸杞中的多糖含量进行测定是检验枸杞药用性能的重要方式，但目前采用的传统测定方法测定的准确度不高，寻找一种更适合的枸杞多糖检测方法是目前研究的热点。对此，王梓轩通过建HPAEC-PAD 法对枸杞多糖含量进行测定，解决了传统方法测定枸杞多糖含量时，分离效果不佳和灵敏度低的问题，但该方法对检测条件的要求高，难以进行普及[1]。颉东妹则通过建立微波消解-离子色谱法测定枸杞多糖含量及组成。结果表明，该方法能有效缩短多糖的消解时间，快速检测枸杞内多糖含量，但准确率还有待提高[2-3]。基于此，本试验尝试建立凝胶渗透色谱（GPC）法对枸杞内多糖含量进行测定，从而为枸杞内多糖含量的测定提供一种新的参考。

1 试验部分

1.1 材料与设备

主要材料：枸杞粉（标准品 联峰生物科技）；硫酸钠（AR 邦泽化工）；无水乙醇（启源化工）；磷酸二氢钾（AR 鑫胜化工）。

主要设备：TGL16M 型离心机（凯特仪器）；SHJ-6 型恒温水浴锅（捷呈仪器）；101 型烘箱（华恒试验仪器）；TSKgel G5000 PWXL 色谱柱、TSKgel G5000 PWXL 色谱柱（东曹（上海）生物科技有限公司）;PL-GPC50 型凝胶色谱仪（狮山辉研测试）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

（1）将3 g 枸杞粉按照一定料液比溶于热水中，然后在SHJ-6 型恒温水浴锅的作用下保持一定温度进行浸提。

（2）对混合物以3000 r/min 的转速进行离心处理20 min。离心结束后取溶液上清液，放入3 倍体积的无水乙醇，然后放入冰箱进行冷冻沉淀，冷冻温度和时间分别为4 ℃和6 h。

（3）按照步骤（2）同等的离心条件再次进行离心处理，然后将上清液去除后，在60 ℃的烘箱内低温烘干，最后用去离子水定容至100 mL 容量瓶中，测定枸杞多糖。

1.2.2 GPC 检测方法

将TSKgel G5000 PWXL 色谱柱与 TSKgel G5000 PWXL 色谱柱串联，然后在一定流速条件下将20 μL 待测液泵进色谱柱中进行枸杞多糖分析，记录相关数据。

1.3 性能分析

1.3.1 多糖含量

多糖含量的计算表达式为：

式中，X：样品多糖含量，%；V：多糖定容体积，mL；P：比色样液稀释倍数；K1、K2：分别为样液、0.02 mg/mL 葡萄糖标液吸光值；M：样品的质量。

1.3.2 线性关系考察

通过对不同浓度的标液进行测试并绘制标准曲线[4]。

1.3.3 检测限和定量限

通过GPC 色谱柱对稀释后的葡聚糖标液进行检测，得到基线噪声值，以3 倍信噪比为检测限，以10 倍信噪比为定量限[5-6]。

1.3.4 稳定性

通过同一操作人员每隔4 h 进行检测和不同操作人员进行检测，确定该方法的出峰时间和峰面积，进而表征方法的稳定性[7]。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 浸提温度优化

图1 为浸提温度的影响。由图1 可知，待测液内的多糖含量随浸提温度的升高而增加。这是因为枸杞内的多糖为不同聚合程度的混合物，其中除亲水率较高的分子外，还存在疏水性的大分子多聚物，这些多聚物在溶液中易形成无规则线团，分子与分子间的碰撞增加，增加了溶液黏度，在溶液中表现为凝胶状态，这就降低了该类分子的溶解度[8-9]。当体系温度增加，水分子的流动性也随之增加，这就增大了大分子多糖的溶解度，因此提取出来的多糖含量也较高。因此，浸提温度选择为100℃。

2.1.2 浸提时间的优化

图2 为浸提时间优化结果。由图2 可知，浸提4h 时，浸提液中多糖含量最高。出现这个变化的主要原因在于，枸杞中含有的部分多糖溶解速度较慢，需要较长的时间才能在水中溶解，因此浸提液中多糖含量随浸提时间的增加，也在缓慢增加。但过长的浸提时间会导致浸提液体系内蛋白质等可溶物质含量过多，进而对多糖的溶解产生抑制作用，使得浸提液体系内的多糖含量有一定下降[10]。因此，选择适合的浸提时间为4 h。

图2 浸提时间优化结果Fig. 2 The optimization results of extraction time

2.1.3 浸提料液比优化

图3 为料液比优化结果。由图3 可知，当料液比为1∶30 时，浸提液内多糖含量最高。这是因为，料液比的增加，使得溶剂水的用量随之增加，这就增加了多糖在溶液中的饱和容量，可以提取出更多的枸杞多糖。但枸杞中可溶解的多糖数量有限，当料液比过大，溶剂水的用量过多，单位体积溶剂水内含有的多糖量有一定下降[11-12]。同时，过多的溶剂水会对后续浓缩工艺产生影响，因此在提取过程中，选择适合的料液比为1∶30。

图3 料液比优化结果Fig. 3 The optimization result of ratio of material to liquid

2.1.4 浸提次数的影响

图4 为浸提次数优化结果。由图4 可知，浸提3次浸提液内的多糖含量最多。出现这个变化的原因与料液比对提取液内多糖含量的影响一致，过多的浸提次数反而对提取枸杞内的多糖产生不良影响。因此可认定适合的浸提次数为3 次。

图4 浸提次数优化结果Fig. 4 The optimization results of extraction times

2.2 方法检测条件的优化

2.2.1 流动相优化

通过GPC 检测枸杞内多糖含量时，流动相的选择是影响数据的关键因素。本试验选择Na2SO4和KH2PO4、水作为流动相，浓度均为0.02 mol/L），观察不同流动相的影响，结果见图5。由图5 可知，以纯净水作为GPC 流动相时，基线漂移，分离效果不理想，当水流速为0.6 mL/min 时，产生的柱压明显高于规定柱压，因此不考虑纯净水作为流动相。而KH2PO4和Na2SO4流动相产生的色谱图峰的个数和峰型没有太大的差别，但KH2PO4的柱压相对较低，同时基线也更为平整，这就说明以KH2PO4作为流动相时，表现出更好的分离效果，因此在后续试验中，选择0.02 mol/L 的KH2PO4作为流动相。

图5 流动相优化结果Fig. 5 The optimization results of mobile phase

2.2.2 流速的优化

流动相流速的优化见图6。由图6 可知，两种流速条件下产生的色谱图峰峰面积和峰型没有太大差别，仅在出峰时间上有一些差异。当流速为0.6 mL/min 时，出峰时间明显较短，则检测分析时间越短，检测效率越高[13-14]，因此选择流速为0.6 mL/min。

图6 流速优化结果Fig. 6 The optimization results of flow rate

2.2.3 柱温的优化

柱温也是影响GPC 色谱柱检测的重要因素，根据相关参考文献，选择35 ℃和40 ℃柱温条件进行检测，结果见图7。由图7 可知，在两种柱温条件下，得到的色谱图峰型基本一致，也就是说在这两种柱温条件并不对检测结果产生影响。考虑柱温对检测柱使用寿命的影响，选择适合的柱温为35 ℃。

图7 柱温优化结果Fig. 7 The optimization results of column temperature

2.3 方法考查

2.3.1 标准曲线及线性范围

图8 为方法标准曲线。由图8 可知，多糖含量测定与线性回归方程的相关系数R2超过0.99，枸杞多糖含量检测与线性回归方程表现出良好的相关性，可以用该方法进行枸杞多糖含量检测。

图8 多糖含量标准曲线Fig. 8 The standard curve of polysaccharide content

2.3.2 检测限和定量限分析

通过GPC 色谱柱对稀释后的葡聚糖标液进行检测，得到基线噪声值，以3 倍信噪比为检测限，以10 倍信噪比为定量限，确定检测限和定量限分别为0.50 μg 和1.67 μg。

2.3.3 精密度试验

用同一浓度进行重复进样，表征方法的精密度，结果见表1。由表1 可知，同一样品重复进样5次后，出峰时间与峰面积的相对标准偏差分别为0.08%和2.28%，表现出良好的重现性和精密度。

表1 精密度测试结果Table 1 The precision test results

2.4 实际样品检测

图9 为实际样品测试结果。由图9 可知，同一时期不同产地的枸杞和同一产地不同时期的枸杞，其含有的多糖含量也不一致，其中宁夏秋果的多糖含量最高，约为5.5%，青海夏果的多糖含量最低，约为3.2%，与相关文献测试的枸杞多糖含量一致，这就说明GPC 检测结果符合实际情况，可以用于枸杞多糖含量的检测[15]。

图9 实际样品检测结果Fig. 9 The test results of actual samples

3 结 论

通过以上研究，得到以下结论：

（1）样品前处理条件优化结果为：浸提温度为100 ℃；浸提时间为4 h；浸提料液比为1∶30；浸提次数为3 次。

（2）GPC 检测优化结果为：选择0.02 mol/L 的KH2PO4作为流动相；流速为0.6mL/min；柱温为35℃。

（3）检测方法验证结果为：干扰物质的色谱峰位置均在保留时间38 min 左右，而葡聚糖标液色谱峰为16~31 min 间。这就说明多糖与干扰物质可以很好的分离；线性方程与枸杞多糖含量相关系数R2超过0.99，检测限和定量限分别为0.50 μg 和1.67 μg，同人操作和不同人操作的出峰时间RSD分别为0.03%和0.02，峰面积RSD 分别为3.48%。和2.5%。重复进样后，出峰时间与峰面积的RSD 分别为0.08%和2.28%，表现出良好检测性能。

（4）宁夏秋果的多糖含量最高，约为5.5%，青海夏果的多糖含量最低，约为3.2%，与相关文献测试的枸杞多糖含量一致，这就说明GPC 检测结果符合实际情况。