干细胞在子宫内膜治疗中的研究进展

代阳阳,辛廖冰,叶子,张松英

人类子宫内膜结构复杂,包含多种细胞成分,如上皮细胞、间质细胞、血管内皮细胞、免疫细胞等。子宫内膜随着体内雌孕激素的波动发生周期性增殖、分化、退化、脱落和再生。严重的子宫内膜损伤或感染可导致子宫内膜正常结构的破坏,出现子宫内膜纤维化、内膜过薄或慢性炎症。这些病变不利于囊胚着床,影响子宫和胎儿早期的血液供应,容易导致反复流产或不孕。干细胞是一种未分化细胞,具备自我复制和多向分化潜能[1],干细胞疗法作为再生医学的一种新兴的治疗方法在子宫内膜重塑领域引起了人们的极大关注[2]。移植外源性干细胞或干细胞衍生物均可减少子宫内膜纤维化,增加子宫内膜腺体数目和内膜厚度,促进子宫内膜的新生血管生成,调节局部免疫微环境,提高妊娠率。本文对干细胞在子宫内膜治疗中的研究结果进行综述。

1 子宫内膜的生物学特性

1.1 子宫内膜的生理特性

人类子宫内膜分为外功能层和内基底层。前者由致密的腺体组织和疏松的结缔组织间质组成,在月经期发生脱落;后者包括血管、腺体基底层及致密层,在月经周期中保持恒定。子宫内膜具有高度再生能力,在正常月经周期中,功能层脱落后,内膜创面会迅速上皮化和逐步增厚,实现无瘢痕的完全修复和功能重建,子宫内膜的完整性保证了正常月经的形成和胚胎的顺利植入。

1.2 子宫内膜干细胞

子宫内膜的高度自我修复和更新能力使研究者推测其中存在干细胞,这种干细胞在内膜的周期性无瘢痕再生中发挥了重要作用[3]。Chan RWS等[4]在2004年首次从人子宫全切标本的内膜组织中分离并鉴定出一类具有克隆形成能力的细胞(colony-forming unit fibroblasts,CFU-F),CFU-F可被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和骨细胞,具有间充质干细胞的典型分子标志。在小鼠的子宫内膜中也存在一群标志保留细胞,同样具备干细胞的多向分化潜能和分子标志[5]。CD140bCD146是目前最为广泛采用的子宫内膜干细胞(endometrial mesenchymal stem cell,eMSC)的表面标志。利用表面分子标志,研究者发现eMSCs主要定位于内膜基底层和功能层的血管周围,而基底层中eMSCs含量明显高于功能层[6]。

eMSCs在子宫内膜的周期性修复中起到重要作用。eMSCs含量在月经周期各个时期基本稳定,且各时期的eMSCs在克隆形成能力上也无明显差异,但月经期eMSCs表现出更强的自我更新能力,这提示月经期子宫内膜微环境的改变会激活eMSCs的增殖能力,促进月经后的组织修复[6]。小鼠子宫内膜中的标志保留细胞在分娩后表现出明显的增殖行为,待子宫内膜完全修复后,这些细胞则重新回归静息状态[7]。这些研究结果表明,eMSCs对生理状态下内膜修复至关重要,当内膜中eMSCs数量不足和/或功能障碍时,就可能导致内膜增生和/或功能障碍。

2 子宫内膜的病理变化及其发病机制

子宫内膜纤维化是由子宫内膜损伤、侵袭性刮宫术、炎症等原因引起的子宫内膜基底层损伤,是导致子宫性不孕症最常见的病理变化。功能层再生修复障碍导致内膜部分或完全缺失,子宫创面由于缺乏上皮层覆盖而发生粘连,形成宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)或更严重的Asherman综合征。内膜基底层损伤及局部炎症还会引起薄型子宫内膜,其病理可表现为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达下降、血管发育异常、子宫血液供应减少、内膜纤维化和腺体数量减少。不明原因的子宫内膜动脉血流阻力升高引起腺上皮发育不良,而VEGF主要由腺上皮细胞产生,这两者互相影响最终导致薄型内膜[8]。此外,内膜干细胞的功能缺陷也是引起薄型内膜的重要原因[9]。

子宫内膜炎是另一种与不孕症相关的内膜病理状况,组织学上表现为子宫内膜间质中浆细胞浸润。慢性炎症子宫内膜中固有免疫和适应性免疫细胞比例升高[10]。

3 子宫内膜再生的干细胞治疗

正常的子宫内膜是妊娠发生和维持的基础,薄型内膜、IUA等内膜异常性疾病会使内膜容受性降低,导致女性生育力下降甚至不孕。因此,促进子宫内膜无瘢痕再生并提高内膜容受性是治疗内膜性不孕的关键。目前临床常用疗法如手术、激素补充、宫腔内放置屏障装置等在一定程度上可以促进内膜再生并改善患者的妊娠结局,但部分中重度IUA患者术后粘连复发率高,仍存在子宫内膜修复障碍。干细胞疗法为薄型子宫内膜和IUA等疾病治疗提供了新的思路。

3.1 干细胞治疗

3.1.1 骨髓间充质干细胞 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmMSCs)从骨髓间质中分离,易获取且培养周期短,是再生医学领域最常用的干细胞之一。在人和小鼠的子宫内膜中,都发现了bmMSCs的存在,故bmMSCs很可能对内膜再生有促进作用[11]。

Alawadhi F等[12]从雄性小鼠骨髓中提取bmMSCs并注射入雌性小鼠体内,后续检测发现,受损内膜处可以检测到更多的Y染色体阳性细胞,这说明损伤内膜可募集bmMSCs到子宫内膜局部。此外,接受bmMSCs移植的小鼠内膜损伤处纤维化程度减轻,妊娠率得到显著提高。在另一研究中,Cervelló I等[13]将人CD133+的bmMSCs通过小鼠尾静脉注射或宫腔注射的方式移植,观察到bmMSCs在子宫内膜血管旁聚集,并且显著促进了周围内膜细胞的增殖并减轻了细胞外基质的沉积。Wang G等[14]发现,注射bmMSCs后,大鼠受损内膜雌孕激素受体表达水平上升,而雌孕激素受体水平与内膜的容受性密切相关。比较尾静脉注射和宫腔注射后的bmMSCs驻留率发现,接受尾静脉注射的小鼠子宫处能检测到更多的外源bmMSCs,并且能获得更好的组织修复和功能恢复[15],这一差异或许是因为宫腔内的干细胞悬液有可能随着子宫收缩被排出体外影响了治疗效果。尽管给药途径不同可能导致修复效果的差异,但无论静脉注射或宫腔注射都能促进内膜的修复并提升动物IUA模型的生育力。

3.1.2 脐带间充质干细胞 脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,ucMSCs)具有低免疫原性、高自我复制潜能、易获得的特点,能分泌多种活性细胞因子发挥免疫调控和促进组织修复效应。Sun B等[16]将ucMSCs与米非司酮诱导损伤的内膜间质细胞共培养后发现,ucMSCs可显著改善受损内膜间质细胞的形态和增殖能力。Zhang L等[17]发现尾静脉注射ucMSCs可以改善酒精损伤大鼠的子宫形态,并可提高大鼠的妊娠率和胚胎数量,在组织学上则表现为内膜纤维化水平降低,新生血管增多,此外,ucMSCs在大鼠体内也表现出抗炎效果:接受2次和3次ucMSCs注射的大鼠子宫内膜促炎因子干扰素γ和肿瘤坏死因子α水平均显著下降。此外也有研究发现,ucMSCs促进子宫内膜修复的机制也可能与Akt信号通路有关[18]。

3.1.3 经血间充质干细胞 经血间充质干细胞(menstrual blood mesenchymal stem cells,menMSCs)是从健康女性月经血中收集提取得到的一类间充质干细胞,具有和bmMSCs相似的分化潜能。menMSCs和其他类型MSCs具有许多相似的特性,如促修复、免疫调节与促血管新生等。Zhang Y等[19]发现menMSCs在体内可以激活Akt和ERK信号通路,促进VEGF等细胞因子的表达,促进内膜局部血管新生,改善内膜形态并提高生育力;在体外,menMSCs可以促进血管内皮细胞的迁移和增殖,抑制氧化应激所导致的细胞损伤。Wang X等[20]将menMSCs与血小板源性生长因子共同注射于小鼠损伤的宫腔中,发现二者能够激活内膜局部的Akt和BAT,并增强CD34的表达,在促进内膜修复的效果上具有协同作用。

3.1.4 脂肪来源间充质干细胞 脂肪来源间充质干细胞(adipose tissue derived mesenchymal stem cells,adMSCs)是从脂肪组织中分离得到的一类成体干细胞,基质血管旁成分(stromal vascular fraction,SVF)是提纯adMSCs前的一类混合细胞群,这两者均具有明显的促修复效应。adMSCs可调节内膜间质细胞的行为,并减少细胞外基质沉积,这提示adMSCs对于内膜异常纤维化可能有修复效果[21]。体外培养的adMSCs可以分化成子宫内膜上皮细胞,接受adMSCs移植的大鼠受损子宫在30 d时可以观察到内膜明显增厚,腺体和微血管数目显著增加,并且再生内膜处的雌孕激素受体表达水平也得到恢复,与对照组相比,adMSCs移植组的妊娠率明显提高[22]。在小鼠模型中,移植adMSCs能够提高骨形态发生蛋白-7和Smad5的表达水平,提示adMSCs可能通过这一通路促进内膜组织的修复[23]。

3.1.5 人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞 人羊膜间充质干细胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,hAMSCs)来源于人羊膜上皮层下间质,人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)来源于羊膜上皮层,都表现出典型的干细胞特性[24]。研究证明,hAMSCs和hAECs对子宫内膜均有良好的修复作用,在动物模型中表现为内膜厚度增加、腺体数量增多、微血管形成旺盛以及纤维化程度降低等,能促进生育力的恢复。Li B等[25]发现hAECs能促进内膜间质细胞增生,并可能通过促进VEGF表达促进血管新生。Yu J等[26]证实了Notch信号通路的激活参与介导hAMSCs向内膜上皮细胞的分化从而促进内膜再生。并且hAMSCs和hAECs能够调节内膜局部的微环境,抑制炎症因子和促纤维化因子TGFβ的表达[27]。

3.2 干细胞衍生物治疗

间充质干细胞在移植后主要通过旁分泌作用发挥效应,如干细胞分泌组中的亲环素A可促进内膜局部血管新生[28]。间充质干细胞还可分泌细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV),包括外泌体(exosome,exo)、凋亡小体和微囊泡[29],其表面和内部含有一些活性物质如蛋白质、脂质、RNA、DNA和细胞因子等。

间充质干细胞来源的外泌体在子宫内膜修复中的研究获得了广泛关注。Feng Y等[30]在体外观察到,ucMSC来源的外泌体(ucMSC-exo)能够促进内膜腺上皮细胞的迁移能力。在动物模型中,ucMSC-exo单独或联合雌激素使用均能发挥显著的免疫调节效果,减轻内膜局部炎症反应,增加内膜VEGF表达,显著降低内膜纤维化程度[31]。在大鼠中,bmMSC-exo能够改善内膜间质细胞的铁死亡[32]。MSC-EVs中的miRNA是参与内膜修复的重要分子,miR-233-3p能够增强内膜上皮前体细胞的活性[33]。Yao Y等[34]发现bmMSC-exo能够逆转TGFβ1诱导的内膜上皮间质转化,在兔IUA模型中,bmMSC-exo也可以显著抑制TGFβ1和TGFβ1R的表达,降低纤维化程度。

间充质干细胞在移植后由于宿主免疫排斥等因素容易发生凋亡,但干细胞移植仍能发挥修复效应,因此凋亡小体介导的修复效果逐渐受到关注。笔者所在团队首次报道ucMSCs宫腔移植后会迅速凋亡,干细胞凋亡小体可能进一步发挥修复效果。因此体外制备干细胞凋亡小体并将其负载于水凝胶中,体内外实验证实负载了凋亡小体的水凝胶表现出良好的促进细胞增殖、调控细胞代谢,免疫调节,促血管新生以及降低纤维化的效果,接受负载干细胞凋亡小体凝胶治疗的动物子宫生育力得到了显著恢复[35]。这一研究为干细胞修复子宫内膜的研究方案提供了新的选择,也为干细胞疗法的机制提供了新的角度。

3.3 干细胞疗法与生物材料的结合

生物材料的应用对再生医学有着重要作用。目前内膜再生领域常用的生物材料主要有胶原支架、透明质酸水凝胶、脱细胞支架等。

胶原支架的引入为干细胞提供粘附,延长了干细胞在宫腔的驻留时间,并在损伤急性期为宫腔提供一定的物理阻隔,减少粘连形成[36]。利用胶原支架负载间充质干细胞可实现干细胞的原位递送并增强干细胞的修复效果[37],除递送干细胞外,本团队在胶原支架上负载UCMSC-exo,发现胶原支架复合外泌体能够促进局部巨噬细胞的M2表型转变,实现内膜的修复[38]。

透明质酸在临床已被广泛应用于宫腔操作后预防粘连的发生。利用透明质酸水凝胶可以实现在宫腔递送间充质干细胞或外泌体等,促进子宫内膜的修复[39-40]。本团队在前期研究中,同样采用透明质酸水凝胶作为递送干细胞凋亡小体的载体,在IUA的急性与慢性损伤模型中均实现内膜组织学与生育力的修复[35]。

脱细胞支架保留了细胞外基质基本的组成成分及三维空间结构,其表面天然的分子结构能作为调节细胞行为的信号[41]。人羊膜脱细胞支架和人绒毛膜脱细胞支架能够促进间充质干细胞的体外增殖并高表达VEGF和血管生成素等因子,将adMSCs负载于人羊膜脱细胞支架后,可实现大鼠损伤内膜增厚、腺体数量增加以及生育力的恢复[42]。

3.4 干细胞促进子宫内膜再生的临床研究

2011年Nagori C等[43]首次利用重度IUA患者自身bmMSCs进行宫腔灌注,术后随访发现患者超声下子宫内膜增厚至8 mm,并通过体外受精-胚胎移植成功妊娠。Singh N等[44]采用超声引导子宫内膜下注射自体bmMSCs的方法治疗了6例重度IUA患者,随访发现这些患者子宫内膜均获得了不同程度的增厚。该团队后续纳入更多IUA和薄型子宫内膜患者,并对其中15例随访5年后发现,这些患者除内膜厚度增加外,3例患者成功妊娠并生产[45]。在另一项前瞻性研究中,Santamaria X等[46]分离复发性宫腔粘连患者自身CD133+bmMSC并注射入子宫螺旋动脉,术后3个月和6个月超声和宫腔镜随访发现宫腔形态改善且子宫内膜厚度增加。在后续的回顾性研究中,De Miguel-Gómez L等[47]分析此前接受自体CD133+bmMSCs移植前后的内膜标本,发现bmMSCs移植后可能通过旁分泌作用促进了内膜局部增生和血管新生相关因子表达,并降低内膜局部炎症反应。近期有研究报道,富血小板血浆宫腔灌注联合自体bmMSCs干细胞移植可实现内膜生育力的恢复[48]。Zhao G等[49]利用胶原支架负载患者自体bmMSCs后移植入宫腔,发现内膜局部ΔNp63表达降低,内膜增生活跃,在接受移植的10例患者中,5例成功妊娠并生产。我国一项纳入53例患者的临床试验结果显示,接受自体bmMSCs或自体bmMSCs联合透明质酸凝胶宫腔移植的患者,术后子宫内膜均获得明显增厚,并且妊娠率显著增加[50]。

ucMSCs应用于人体子宫内膜修复的有效性和安全性也有相应的临床证据。Cao Y等[51]将ucMSCs负载于胶原支架后移植到因复发性IUA而不孕的患者宫腔内,随访30个月未发现与移植相关的严重并发症;与治疗前相比,26例患者内膜平均厚度明显增加,组织学分析证实内膜雌激素受体Ki67等表达量上升,并且10例接受治疗的患者成功妊娠,8例患者分娩健康后代。本团队也开展了ucMSCs结合胶原支架治疗IUA的临床试验,在完成试验的16例患者中均未发生与治疗相关的严重并发症,术后3个月随访可观测到内膜平均厚度显著提高(5.87±0.77 mm vs 4.08±0.26 mm),免疫组化提示内膜处雌孕激素受体表达升高、细胞增生和血管新生活跃;3例患者治疗后通过冻胚移植成功妊娠,2例患者自然妊娠[52]。

其他已应用于临床研究的干细胞包括自体月经血来源间充质干细胞以及自体脂肪间充质干细胞或基质血管旁组分。在一项纳入7例重度IUA患者的前瞻性研究中,接受自体menMSCs移植的患者内膜均有明显增厚,5例患者内膜厚度达到胚胎移植标准,并且2例移植后成功妊娠并生产[53]。在另一项单中心研究中,Lee SY等[54]评估了移植后患者自体脂肪来源基质血管旁组分对其内膜修复的效果,发现内膜厚度显著增加,且未发生与移植有关的严重并发症,这说明自体脂肪来源干细胞用于内膜修复是安全且有效的。

4 小结

IUA和薄型子宫内膜是导致全球女性不孕的两大病因。目前临床传统治疗手段并不能很好防止中重度IUA的复发。与传统治疗相比,干细胞疗法能使内膜达到更好的修复效果。然而干细胞疗法也存在一些亟待解决的问题,如移植后局部驻留率低、免疫排斥、干细胞质量控制未建立统一标准等,临床应用面临阻碍。干细胞衍生物研究应用实现了干细胞疗法的“无细胞治疗”,这些衍生物在降低活细胞疗法潜在风险的同时保留了干细胞的大部分生物效应,但其制备过程相对更复杂。生物材料的引入是干细胞疗法的另一突破。生物支架不仅能为内膜修复提供必要的物理支撑,也可以作为干细胞或衍生物的递送载体,延长局部驻留时间,增强修复效果。并且随着研究进展,越来越多具有特殊性质的新兴生物材料不断涌现,如可注射水凝胶、温敏水凝胶、缓释胶原支架等,这些生物材料的发展为内膜修复提供了更多的可能性。干细胞疗法在人体用于内膜修复的研究仍然较少,目前仍缺少严格设计的多中心大样本临床研究提供更充足的临床证据推动利用干细胞修复子宫内膜的疗法从实验到临床的转化。再生医学技术在不断发展,新的研究结果也不断涌现,相信在不久的将来,子宫内膜修复能够取得新的突破。