胚胎发育停滞的研究进展

张亚南,叶飞,魏家静,刘伟信,曾玖芝,侯明霞,熊东升

据世界卫生组织统计,全球不孕不育夫妇数量逐年上升,目前已达6 000万～8 000万对。我国不孕不育患者已占到育龄夫妇的15%[1],辅助生殖技术逐渐成为不孕夫妇治疗的重要手段。为了进一步提高胚胎移植妊娠率,胚胎学家通过延长胚胎体外培养时间对胚胎进行早期筛选,从卵裂期到形成囊胚的过程中只有发育潜能较好的胚胎才有最终被移植或者冷冻的机会,发育不好的胚胎则在培养过程中被淘汰。研究表明,细胞凋亡是胚胎早期发育停滞的主要方式,也是导致辅助生殖技术不良结局的重要因素[2]。本文将对胚胎发育停滞的影响因素做以下综述。

1 胚胎发育停滞的机制

着床前胚胎在体外培养过程中往往会发生“发育停滞”现象,并且发生的时间节点不尽相同,胚胎体外培养发育到1-2细胞之前一直处于从生殖细胞分化到胚胎细胞、由母型过渡到合子型的转变过程,同时细胞内部结构及机制也在不停转换[3]。植入前胚胎基因组的激活发生在2细胞晚期。因此,胚胎从受精卵到2细胞阶段主要依赖的是母源因子[4]。

核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是细胞内一种重要的转录因子,可以调节细胞及肿瘤细胞内众多的抗氧化反应,调节细胞增殖及增强细胞对氧化应激的抗性。有研究表明,鸦胆子苦醇(brusatol)可以抑制Nrf2信号通路,并且下调Nrf2蛋白的表达,抑制细胞周期由G2到M期的转变,进而抑制胚胎的发育[5]。

另有研究指出,用35S标记2细胞期体外发育停滞的胚胎,结果显示蛋白质合成图谱有改变,在正常情况下2细胞期应该表达的蛋白在停滞的胚胎中没有表达。胚胎发育越过2细胞期后,新合成蛋白的总量及合子型产物占其中的比例也随之增加。对2细胞停滞胚胎和经茵香霉素(一种蛋白合成抑制剂)处理的胚胎进行比较分析还发现,蛋白质合成的速率直接影响胚胎的发育潜能[6-7]。

2 胚胎发育停滞的多因素分析

2.1 线粒体功能异常对胚胎发育的影响

线粒体是所有哺乳动物卵子和植物早期细胞组织中含量最丰富的一类细胞器,其功能特点是经氧化磷酸化作用产生三磷酸腺甘醇(ATP)等,为胚胎细胞分裂、代谢合成过程提供能量物质。受精过程结束后由精子携带的线粒体发生退化,后期胚胎在发育过程中所需的能量均由卵母细胞内的线粒体提供[8-9]。

线粒体的功能一旦发生异常就可能导致胚胎发育停滞。Thouas GA等[10]用若丹明-123使鼠受精卵线粒体渗透性增加、功能丧失,受精卵发育停滞;又用环孢霉素A抑制线粒体渗透性,受精卵的发育部分恢复。Tarazona AM等[11]先用荧光探针直接测量牛卵母细胞线粒体活性,并将牛MⅡ期卵母细胞中线粒体荧光规定为100%,发现胚胎发育到16细胞以上时,线粒体活性仅保持在大约16%～50%,发育较差的胚胎线粒体活性不足15%。与线粒体功能低下相反,鼠胚在2-4细胞期ATP产量异常增多,到桑葚胚ATP反而下降,从而导致细胞死亡。出现这一现象的原因是ATP产生过多时,自由基等有害物质也大量产生,使线粒体晶体(由两个阳离子和无机磷酸组成)出现,线粒体晶体可以阻碍氧化磷酸化反应,使8细胞胚胎线粒体功能减退、发育停滞。

由此可见,当细胞线粒体内呼吸酶功能不足时,不能产生足够的ATP来维持细胞基本生命活动;而由于线粒体功能降低,在传递大量电子过程中线粒体所释放出的负活性氧、自由基等有害物也随之增多[12]。

2.2 绒毛染色体数目异常与胚胎发育停滞的关系

在人类胚胎非整倍性筛查中发现,许多采用辅助生殖技术助孕的患者妊娠失败的原因是胚胎的非整倍性[13]。染色体分离过程中数目异常是由于双亲中有一方的配子在形成或者受精卵在卵裂初期出现染色体不分离,因此出现了单倍体或者三倍体[14]。研究表明,胚胎停滞患者绒毛染色体数目的异常分离与胎儿性别无关,但是累计流产3次或5次以上的严重习惯性流产者,胎儿染色体数目异常发生率显著升高[15]。随着女性年龄增加,虽无不良孕产史,卵子质量也呈下降趋势,卵子退化及畸形现象的发生率越来越高[16]。另外,受精卵细胞内纺锤丝老化,会导致卵子受精后功能减退,导致早期胚胎发生停滞[17]。

2.3 MTOR信号通路与胚胎发育停滞的关系

MTOR(the mammalian target of rapamycin)即来源于哺乳动物体内的雷帕米松霉素的靶源蛋白,最早在酵母属生物中被发现,随后人们又相继在其他某些低等哺乳动物细胞组织中发现[18]。MTOR信号通路主要调控细胞的生长、分化、迁移及自我复制等功能,不仅参与胚胎分裂整个生理过程,对胎儿出生后的生长发育也有调节作用[19]。MTOR信号通路在酵母体细胞中的一项基本调控功能是通过感受外界营养状况控制酵母细胞正常生长,当培养条件比较适合生长时,MTOR通路可被激活,从而调节酵母细胞生长、出芽[20]。

在一些关于哺乳动物的研究中,MTOR通路可以整合细胞外的信号,从而调控细胞的生长、增殖、分化和发育等生理功能,同时参与细胞蛋白质的转录和翻译过程,若此通路失调可能导致细胞的异常增殖,甚至发生癌变[21]。一定程度上抑制MTOR通路,可以有效调控胚胎相应区域的蛋白质合成,以及磷酸化与修饰反应的抑制程度,导致哺乳动物体内的胚胎生长发育受阻[22]。

2.4 活性氧水平对胚胎发育停滞的影响

活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要是指体内所产生的氧自由基及氧化作用较强的非自由基和含氧产物的总称,主要有氧负离子、超氧离子、羟基自由基及过氧化物等。线粒体是ROS产生的主要细胞器,参与细胞代谢及能量供应,若ROS产生过多则会抑制细胞内生长因子的作用,甚至导致细胞死亡。

ROS能够增强肿瘤蛋白因子P53的表达,ROS聚集越多,肿瘤蛋白因子P53表达量越高,使胚胎在体外生长过程中质量下降,导致发育停滞并最终死亡[23]。

体外培养条件下ROS能够诱导胚胎细胞产生应激因子,增加氧化应激反应和其他异常成份,降低胚胎自我修复功能,同时使正常胚胎发育能力受到影响,被临床认为是影响胚胎发育的重要因素。

2.5 基因突变对胚胎发育停滞的影响

早期胚胎发育是成熟的卵母细胞与精子结合形成合子,通过减数分裂和有丝分裂形成卵裂期胚胎及囊胚。在此过程中同源染色体通过纺锤体的牵引向两级分化,微管蛋白在分裂过程中发挥着重要功能[24]。TUBB8基因是一种特殊的微管蛋白亚型,该基因的突变有可能导致卵母细胞成熟障碍及胚胎在发育过程中出现发育停滞现象[25]。

TUBB8基因只存在于灵长类动物中,目前已发现的有82种TUBB8突变基因型,且临床表型各不相同,如发生突变,可导致未成熟卵母细胞发育停滞、受精卵无法正常卵裂及早期胚胎发育停滞和反复着床失败等[26]。出现以上现象的原因是由于TUBB8基因突变影响了卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的形成和组装,导致染色体分离不均匀,形成非整倍体胚胎,继而无法正常发育,或者可以形成MII期卵母细胞,能正常受精和卵裂,但在2-8细胞期就不再继续发育[27]。

2.6 不同培养基成分对胚胎发育停滞的影响

一些国外学者在早期研究中采用的M16培养液是直接对小鼠胚胎细胞体外培养,但由于对远交系小鼠进行胚胎发育研究容易导致胚胎发育停滞的异常现象,为了克服这种停滞现象,研究者通过对培养液的成分进行优化、调整得到了KSOM培养液,直接将胚胎在KSOM培养液中进行培养,有效降低了小鼠胚胎在体外发育时的停滞率[28]。

KSOM培养液相对于M16培养液来说在Na+、K+、Ca2+的配比上进行了平衡优化,Na+、K+、Ca2+主要通过与环境介质中气体分子中的电子相作用,从而保持细胞质中电子平衡,在此过程中O2发挥着不可替代的作用。由此证明,小鼠胚胎体外发育是否正常与培养液成份及温度条件有着直接关系[29]。

2.7 男性精子异常对胚胎发育停滞的影响

随着辅助生殖技术的进步,男性因素导致的不育受到广泛关注[30]。以往关于生育障碍的因素大都集中在女性,往往忽略了男性因素。男性精子浓度、活动力、存活率、形态等都是衡量男性生育力的重要指标[31]。精子活力和形态异常,精子畸形率偏高,可能会造成女性自然流产及胚胎发育停滞[32]。Hrsfilan S等[33]研究结果也提示男性精子染色体异常也可能导致不良妊娠结局的发生。

近年来,男性精液质量检测技术也逐步提升。2001年Bartoov B等[34]发明了运动精子细胞器形态学的检查仪器(MSOME)技术,在高倍镜下对精子细胞核进行实时的检测。随后,在此技术基础上又创新融合了数位光学成像技术,其总体放大的倍数约6 600倍,能直接对精子顶体、顶体的后端致密膜层、细胞核、颈部、尾部和线粒体等亚细胞结构进行精细分辨,该技术通过与ICSI技术结合后而被发明者命名为胞浆内形态学筛选精子注射[35],可用于人工通过显微镜筛选精子,有效提高了受精率、着床率,降低了流产率[36]。

3 展望

随着分子生物学的发展,胚胎发育停滞的机理也日渐清晰。目前研究显示,胚胎发育停滞的因素主要集中在胚胎自身基因突变、染色体异常和产生的ROS及胚胎内部的信号通路等方面,由于胚胎发育机制较为复杂,目前未能准确分析胚胎发育停滞的具体原因。近些年虽然在胚胎发育停滞的机制研究上取得了一定成果,但仍有更多空间有待发现和挖掘,只有综合考虑多方面因素,才能降低胚胎发育停滞率。