一例牛中华泰勒虫病的分子生物学诊断及分析

迟 雪，刘耀亮，张子健，李 齐，郭小雨，邢向东，田万年*

1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林市 132101；2.吉林省和龙市科技信息服务中心，吉林和龙 133500

牛泰勒虫病是由泰勒科泰勒的原虫寄生于牛的红细胞内的血液原虫病[1]。寄生在牛红细胞内的泰勒虫，虫体小于红细胞半径，虫体在红细胞内主要呈圆形、杆状、逗点形、环形和梨籽形。其中以圆形和和卵圆形为主，占总数的70%。牛感染泰勒虫主要临床表现为贫血，消瘦，反刍障碍，严重时可引起死亡，给养牛业造成巨大经济损失[2]。国内报道感染牛的泰勒虫主要有东方泰勒虫、环形泰勒虫和中华泰勒虫。国内对中华泰勒虫研究报道较少，中华泰勒虫最先在甘肃省境内发现，主要通过青海血蜱传播，蜱虫每年5月中旬开始叮咬放牧牛群，在6月中下旬达到高峰，在7月中旬蜱虫数量逐渐减少，对中华泰勒虫分子生物学研究对该病的防治具有重要意义。2021年6月27日，吉林省图们市某养殖户饲养的放牧黄牛先后发病，初步诊断疑似泰勒虫感染，对发病病牛采集血液，进行血涂片检测和分子生物学检测，并对泰勒虫MPSP基因进行测序和系统进化树分析，为牛泰勒虫病防治提供分子流行病学资料。

1 发病情况

吉林省图们市养殖户李某饲养15头母牛，6月初开始放牧，6月27日陆续发病。病牛表现为鼻镜干燥，被毛无光泽，反刍障碍，前胃迟缓，贫血，尿液发黄，在牛的颈部和后肢大腿内侧发现大量蜱虫。1头4月龄犊牛出现精神沉郁，被毛逆立无光泽，出现水样腹泻，颈部有大量蜱虫，不能站立，3 d后死亡。对犊牛剖检发现浆膜有出血点，淋巴结肿胀。脾脏肿大，被膜有大量出血点。肝脏肿大，胆囊肿大，充满粘稠胆汁。肠黏膜有出血点，肠系膜淋巴结肿大，出血。

2 实验室诊断

2.1 血液涂片采集

分别对发病牛颈静脉采血10 mL，同时制作血涂片，显微镜镜检。抗凝血放入冰盒内，实验室-20 ℃冰箱保存。血涂片进行标号后，分别加2～3滴甲醇进行固定，室温放置7 min。血涂片放入染缸内进行吉姆萨染色8 h，用蒸馏水对吉姆萨染色后血涂片进行冲洗，自然晾干，用100倍油镜镜检观察红细胞内是否含有泰勒虫体。

2.2 PCR检测及序列测定

按照血液基因组提取试剂盒说明书提取牛血液DNA。根据GenBank收录的牛泰勒虫序列，利用在线引物设计软件设计一对扩增牛泰勒虫通用引物，上游引物：5’- CTTTGCCTAGG ATACTTCCT -3’；下游引物：5’- ACGGCAAGTGGTGAGAACT -3’。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。PCR反应体系为 50 µL ：Taq PreMix 25 µL，上下游引物各1 µL ；DNA 4 µL ；ddH2O 19 µL；PCR 反应条件：预变性温度94 ℃进行5 min，变性温度为94 ℃进行45 s，退火温度58 ℃进行30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环，最后延伸温度为72 ℃进行7 min。经电泳鉴定为阳性PCR产物进行回收，AT克隆。成功克隆到大肠杆菌后，提取质粒DNA进行PCR鉴定和酶切鉴定为阳性大肠杆菌，菌液送往吉林省库美生物技术有限公司测序。

2.3 系统进化树分析

在NCBI数据库中的BLAST中对上述测序完成的产物序列进行全面搜索后，利用序列分析软件DNAStar对搜索后的序列进行分析和拼接，利用MEGA软件与GenBank中公布的已知牛泰勒虫的MPSP基因序列中华泰勒虫（MG950143、GQ180196、MG950143、MG784415、MT240817）、东方泰勒虫（MG733348、MN600030、KY392962）、环形泰勒虫（JX683683、KX904525、AF214840）进行系统进化树分析。

3 检测结果

3.1 血液涂片镜检结果

发病牛血涂片经姬姆萨染色，在显微镜下观察显示：红细胞内发现犁籽形和圆形虫体，染虫率为30%，通过红细胞内虫体形态观察初步诊断为泰勒虫感染。

3.2 PCR检测及测序结果

发病牛血液DNA经PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增出约为798 bp特异片段，而阴性对照未出现特异目的条带。对PCR产物测序后，测序结果进行BLAST对比分析，与GenBank收录的中华泰勒虫新疆分离株（MG950143）同源性为99.12%，表明病牛感染虫种为中华泰勒虫。

3.3 系统进化树分析结果

经MEGA构建系统发育树分析，结果显示，基于泰勒虫MPSP基因的遗传进化树分为两大分支，其中中华泰勒虫与东方泰勒虫处于同一分支，本次测序获得的虫株与中华泰勒虫处于同一分支，与中华泰勒虫马来西亚分离株（MT240817）亲缘关系较近。环形泰勒虫单独处于一个分支，本试验测序获得虫株与环形泰勒虫亲缘关系较远。

4 分析与讨论

牛泰勒虫病是经蜱传播的血液虫病，对外地引进牛和纯种牛危害严重。中华泰勒虫主要流行于我国甘肃、重庆、西藏、新疆、四川、山东等省[3～5]。近年来，随着吉林省大力发展养牛业，中华泰勒虫已成为吉林省养牛业健康发展的主要寄生虫病病原。国内对泰勒虫病的诊断主要通过临床症状结合血液涂片镜检方法，血液涂片检查对操作人员专业水平要求较高，需熟练掌握牛泰勒虫虫体的形态，血液涂片镜检的缺点不能准确区分感染牛的泰勒虫种类，牛在早期感染泰勒虫时因红细胞内虫体染虫率较低，易出现误诊。近年来随着分子生物学技术的迅速发展，PCR检测技术已广泛应用于牛泰勒虫种的分子鉴定，PCR方法具有特异性强、敏感性高的特点，可对牛华泰勒虫进行早期诊断。本试验通过血液涂片镜检和PCR检测方法确定该养殖户病牛感染中华泰勒虫，丰富了中华泰勒虫分子流行病学资料。系统进化分析表明，本试验测序获得的虫株与中华泰勒虫处于同一分支，与马来西亚株亲缘关系较近，与环形泰勒虫亲缘关系较远。本试验结果与白启、刘爱红等[6,7]基于中华泰勒虫18S rRNA序列系统进化分析结果（中华泰勒虫与环形泰勒虫亲缘关系较远）相一致，丰富了中华泰勒虫的分子遗传资料。本试验首次报道了吉林省图们市放牧牛体内存在中华泰勒虫，据报道中华泰勒虫传播媒介为青海血蜱，下一步试验对吉林省图们地区优势蜱种进行形态学和分子生物学鉴定，进一步分析吉林省流行的中华泰勒虫媒介传播来源。

5 防控措施

国内尚未研制出牛泰勒虫病的疫苗，对该病尚无特效药物治疗。对早期感染中华泰勒虫病牛要进行隔离饲养，使用体外杀虫药，临床中治疗该病的药物为贝尼尔和黄色素注射液交替使用，避免药物产生耐药性。病情较严重的牛，可注射含地塞米松、维生素C和青霉素组成的葡萄糖注射液混合溶液进行静脉注射，每天2次。待病牛临床症状缓解后进行驱虫，黄色素剂量按3～4 mg/kg，添加到0.9%氯化钠溶液中进行静脉注射。当病牛出现红细胞、血红蛋白含量显著降低时可进行输血方法治疗，每天输血量为2 000 mL，连续输血3～5 d，直到血红蛋白恢复到25%左右。

中华泰勒虫病的病原学和诊断技术等方面的研究虽然取得了一定进展，但还没有有效的预防控制措施，一般是通过减少其传播媒介的数量来减轻中华泰勒虫病造成的危害及经济损失。中华泰勒虫病的传播媒介为蜱虫传播，具有一定的季节性，与蜱虫的活动季节密切相关。在放牧时，要及时采取灭蜱措施，通过化学药物对牛进行喷洒和人工捕捉方法，控制本病传播。目前，国内还没有中华泰勒虫病的疫苗，因此，放牧时要注意牛颈部和大腿内侧是否有蜱虫，如存在蜱虫时去除体表蜱虫。可在放牧前，对牛舍喷洒杀虫剂，将寄生于牛圈舍内蜱虫杀灭，切断该病的传染源。当牛感染中华泰勒虫后，立即停止放牧，改为舍饲，减少对蜱虫接触。