不同林型农田防护林植物与土壤理化指标及功能基因差异

李德文　周文玲　季倩如　吴嘉仪　刘英

［关键词］林地类型；土壤；叶片；理化指标；功能基因；农田防护林

［摘 要］ 为探讨土壤生态（土壤理化指标及化学计量比）与叶片元素间的相互关系，为林地土壤养分管理及合理施肥提供理论依据，在黑龙江省拜泉县选取落叶松纯林、樟子松纯林、樟子松落叶松混交林3种典型农田防护林类型为研究对象，分析比较了3种农田防护林叶片和土壤的碳、氮、磷含量及其化学计量比。结果表明：混交林的根际土壤电导率、硝态氮含量、全磷含量均显著高于纯林土壤，氮磷比显著低于纯林土壤（P＜0.05），混交林落叶松根际土壤电导率和有机碳、全磷、碱解氮、硝态氮含量均为最高，全氮、铵态氮、速效磷含量也较高；混交林落叶松叶片氮含量及磷含量均显著高于混交林樟子松（P＜0.05），落叶松纯林和混交林落叶松的叶片氮磷比显著低于樟子松纯林（P＜0.05）；3种林型的树种叶片氮磷比均小于14，土壤全磷含量均低于全国森林平均磷含量，植物生长一定程度上受到了叶片氮元素及土壤磷元素的限制；土壤硝态氮含量是土壤中最大的影响因子，真菌基因（ITS）、嗜酸基因（Acidobacteria）、碱性磷酸酶基因（phoD）这3种基因的拷贝数与其呈显著正相关（P＜0.05），也与土壤有机碳含量、全磷含量、速效磷含量、碳氮比等呈正相关关系，而与土壤氮磷比、全氮含量则呈显著负相关（P＜0.05），混交林两树种土壤的这3种基因拷贝数均高于纯林树种。综上，从提高养分利用效率、促进树木生长和保护土壤角度综合考虑，混交林生境优于纯林，其中混交林落叶松的生长状况更佳，同时应注意林下土壤氮、磷肥的补施。

［中图分类号］ S154.4;S714.2［文献标识码］ A［文章編号］ 1000－0941（2023）07－0041－06

碳、氮、磷是植物生长发育最主要的营养元素和限制性元素[1]，是植物体的重要组成部分，主要在植物与土壤环境之间进行转移和交换，对植物生长和各种生理机能的调节有重要的作用，这些元素及它们间的化学计量比是影响生态系统中植物生长的主要因素[2]。覃国铭等[3]对广东米老排叶片的研究表明，3 a生米老排生长主要受磷元素限制；陈婵等[4]对湖南杉木人工林不同器官的研究显示，25 a生杉木的生长更多受到氮元素限制；严正兵等[5]的研究表明，拟南芥叶片氮磷比和碳磷比的增加会导致其比生长速率显著减小。了解植物叶片及土壤的营养元素指标、生态化学计量学特征，对预测不同生态系统的养分变化、植物生产力和生态系统功能具有重要意义。

叶片是植物体内生理代谢最活跃的器官，被认为是对土壤养分供应变化最敏感的部位，其养分含量是土壤养分吸收、大气沉降等输入过程与养分再吸收、淋溶等输出过程平衡作用的结果，在一定程度上反映了林下土壤的养分供应能力[6]。研究表明，植物叶片氮磷比与土壤氮磷比和土壤氮、磷含量变化相关[7]。罗艳等[8]研究显示，柽柳叶片磷含量与土壤全磷含量呈显著正相关关系（P<0.05），铃铛刺叶片氮含量与土壤全氮含量呈显著负相关关系（P＜0.05），与土壤氮磷比呈极显著负相关关系（P＜0.01）。对不同土壤氮磷状况下的小麦叶片研究也发现，灌浆期小麦叶片氮磷比与土壤氮磷比具有极显著的正相关关系[9]。这些显著的相关性都显示出了植物叶片与土壤理化指标及化学计量比特征耦合关系的重要性，说明植物叶片生长与土壤养分间相互作用的重要性。因此，探索土壤理化指标及化学计量比与叶片元素的不同关系，可为促进植物的生长发育及防护林建设提供参考。

土壤微生物与土壤养分转化间存在密切关系，它们共同在生态网络中生活，彼此强烈共存，形成生态簇。这些生态簇中的类群是重要的生态单元，具有共同的环境偏好。SHI Yu et al.[10]在研究中发现，微生物网络中核心节点类群的相对丰度与土壤养分循环功能基因的丰度呈显著正相关关系（P＜0.05），包括碳固定、碳降解、氮循环、磷循环和硫循环等基因，进一步验证了核心菌群对土壤功能基因的促进作用，并揭示了其主控因素。同时，土壤养分的限制可能会影响微生物的生物合成过程[11]。土壤中微生物种类很多，本研究以土壤中具有嗜热（Thermomicrobia）及嗜酸（Acidobacteria）功能的基因、能分解有机物的真菌基因（ITS）、具有磷矿化作用的碱性磷酸酶基因（phoD）的拷贝数为研究对象，通过分析其与土壤养分含量间的相互响应关系，进一步对土壤理化指标及化学计量比与土壤微生物间的相互关系进行探讨。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

研究区选在黑龙江省齐齐哈尔市拜泉县（东经125°30′～126°31′，北纬47°20′～47°55′），位于北大荒腹地、松嫩平原北边缘，海拔260～280 m，基本属于小兴安岭松嫩平原漫岗丘陵地带。研究区属中温带大陆性季风气候区，春旱风大，夏短多雨，秋季早霜，冬冷干燥，四季温差较大，年平均气温1.2 ℃，年均降水量490 mm，年均日照时数2 730 h，年均无霜期122 d。全县超过一半的土壤面积为黑土类土壤[12]，研究区土壤即为典型的黑土类土壤。

1.2 样品采集与制备

本研究选取拜泉县落叶松（Larix gmelinii）纯林、樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）纯林、樟子松落叶松混交林3种典型农田防护林林型进行采样。于2021年5月布设土壤剖面，以抖落法采集附着在根部的土壤为根际土壤，5点混合装样。采集后的样品一部分放入铝盒称量，用于土壤含水率的测定；另一部分装入洁净的布袋，去除杂物、石头等，在阴凉通风处自然风干，用于土壤物理指标和养分含量的测定。准备灭菌过的采样装置（锡箔纸、药勺等）采集提取DNA所用的土壤，采集后直接放入液氮储存，用于后续基因功能分析。运用高枝剪采集不同林木近地位叶片，装入档案袋收集，在阴凉通风处阴干，用于后续理化指标测定。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤及叶片理化性质测定

土壤pH值、电导率等土壤基本理化指标的测定参照土壤农化分析方法[13]。采用重铬酸钾外加热法测定土壤及叶片有机碳含量；采用半微量凯氏定氮法测定土壤及叶片全氮含量；采用靛酚蓝比色法测定土壤铵态氮含量；采用紫外分光光度法测定土壤硝态氮含量；采用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量；采用NaOH熔融-钼锑抗比色法测定土壤及叶片全磷含量；采用NaHCO3提取-钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量[14]。

1.3.2 土壤DNA提取与氮转化功能基因拷贝数测定

土壤DNA使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒（Omega公司生产）提取，提取的DNA放入－20 ℃环境保存，用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度，同时进行凝胶电泳检测，确保获得优质DNA。以细菌16S基因为内参，采用qPCR法（荧光定量PCR法）测定根际及非根际土壤养分循环相关功能基因拷贝数，扩增引物序列及具体的条件[15-18]见表1。

1.4 数据处理

数据结果均采用平均值±标准差的形式表示，采用SPSS 19.0统计分析软件进行多因素方差分析，采用Canoco 5.0软件进行冗余分析，采用WPS表格软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同林型土壤理化指标及化学计量比

由表2可知，不同林型土壤pH值差异不显著，混交林的根际土壤电导率、硝态氮含量、全磷含量均显著高于纯林土壤，氮磷比显著低于纯林土壤（P＜0.05）；纯林中落叶松土壤有机碳含量显著高于樟子松土壤（P＜0.05），混交林中落叶松土壤有机碳含量也显著高于樟子松土壤（P＜0.05）；混交林落叶松土壤电导率和有机碳、全磷、碱解氮、硝态氮的含量均为最高；混交林樟子松碳氮比显著高于其他林型（P＜0.05）；落叶松纯林土壤碳磷比显著高于其他林型（P＜0.05）。

2.2 不同林型土壤功能基因表达量

2.2.1 土壤功能基因拷贝数

由图1可知：除Thermomicrobia外，Acidobacteria、ITS和phoD这3种基因在混交林土壤中的拷贝数都显著高于纯林（P＜0.05）；混交林樟子松及樟子松纯林根际土壤Thermomicrobia拷贝数无显著差异，但均显著高于落叶松根际土壤（P＜0.05）；混交林樟子松根际土壤中4种基因的拷贝数均为最高，且Acidobacteria和phoD的拷贝数均显著高于其他林型（P＜0.05）。

2.2.2 土壤理化指标及生态计量比与功能基因的相关性

对不同林型土壤理化指标及化学计量比与功能基因拷贝数进行冗余分析（Redundancy Analysis，RDA），结果见表3和图2。由表3可知，硝态氮含量是3种林型下根际土壤的最大影响因子，解释度为66.90%（F=20.20，P=0.004）；其次是氮磷比，解释度为63.00%（F=17.00，P=0.002）；土壤全氮含量、全磷含量等也对土壤功能基因影响很大。由图2可知，ITS、Acidobacteria、phoD拷贝数与土壤有机碳、硝态氮、全磷、速效磷含量和碳氮比等呈正相关关系，而与土壤氮磷比、全氮含量呈显著负相关关系（P＜0.05），且3种基因之间呈相互促进作用；Thermomicrobia则受土壤因子影响较小。RDA两轴的累积贡献率分别为79.60%和17.99%。

2.3 不同林型叶片和土壤理化指标及化学计量比之间的关系

2.3.1 不同林型叶片碳、氮、磷含量及化学计量比

由表4可知：不同林型叶片的有机碳含量差异不显著；混交林落叶松叶片全氮含量及全磷含量均为最高，且显著高于混交林樟子松（P＜0.05）；落叶松纯林叶片的碳氮比最高，达到93.40±5.19；落叶松纯林和混交林落叶松的叶片碳磷比显著低于樟子松纯林和混交林樟子松（P＜0.05）；樟子松纯林叶片氮磷比显著高于其他林型（P＜0.05）。

2.3.2 土壤理化指标与叶片碳、氮、磷含量及化学计量比的关系

由表5可知，土壤有机碳含量与叶片全磷含量在0.01水平上正相关（相关系数r=0.838，P＜0.01），与叶片碳磷比在0.05水平上负相关（r=－0.700，P＜0.05），与叶片氮磷比在0.01水平上负相关（r=－0.710，P＜0.01）；土壤铵态氮含量与叶片氮磷比在0.05水平上正相关（r=0.673，P＜0.05）；土壤速效磷含量与叶片全磷含量在0.05水平上正相关（r=0.643，P＜0.05），与叶片氮磷比在0.05水平上负相关（r=－0.685，P＜0.05）；土壤碳磷比与叶片全磷含量在0.05水平上正相关（r=0.631，P＜0.05），与叶片氮磷比在0.05水平上负相关（r=－0.684，P＜0.05）。

由表6可知，叶片全氮含量与叶片碳氮比在0.01水平上负相关（r=－0.949，P＜0.01）；叶片全磷含量同时与叶片碳磷比及氮磷比在0.01水平上负相关，符合统计学规律；叶片碳磷比与其氮磷比在0.01水平上正相关（r=0.920，P＜0.01）。

3 讨 论

土壤养分极大程度影响植物生长[19]。本研究中，混交林落叶松根际土壤电导率和有机碳、全磷、碱解氮、硝态氮含量均为最高，全氮、铵态氮、速效磷含量也较高（表2），说明混交林落叶松土壤营养元素含量较高；樟子松纯林土壤全氮含量最高，为1.32±0.09 g/kg，达到全国土壤养分含量分级标准表[20]的中上等级；3种林型土壤全磷含量最高值为0.14±0.006 g/kg，显著低于全国土壤磷含量，说明拜泉县防护林土壤磷缺失限制了植物生长。

土壤微生物在土壤养分循环中起着至关重要的作用[21]，土壤养分对不同的微生物也存在着调控作用。混交林的两树种根际土壤ITS拷贝数显著高于纯林（见图1），这可能是导致两纯林土壤全氮含量高于混交林樟子松的原因。土壤有机碳含量和全磷含量呈显著正相关关系，与土壤全氮含量和氮磷比呈显著负相关关系（见图2）。本研究中混交林樟子松土壤的Acidobacteria和phoD拷贝数都显著高于其他林型，而FIERER et al.[22]的研究表明，Acidobacteria的相对丰度与平均降水量、土壤有机碳含量和土壤碳氮比都呈显著正相关关系（P＜0.001），混交林落叶松土壤有机碳含量最高，但混交林樟子松土壤Acidobacteria拷貝数高于混交林落叶松，可能是该林型土壤有机碳受ITS影响更大导致的。phoD基因在土壤养分循化中起磷矿化作用，对植物营养有重要意义，通常情况下，土壤碳氮比低于25的有机碳化合物都易发生矿化作用。本研究中，两纯林土壤碳氮比低于25，更易受到phoD基因调控。在磷限制的情况下，混交林落叶松根际土壤全磷含量最高，土壤碳磷比又与叶片全磷含量呈显著正相关关系，进一步说明了混交林落叶松在这几种林型与树种间优势度高。

通过生物体内元素含量的变化及元素比值的高低，可以判断生物体的营养及生长状态，进而揭示生态系统中各养分元素的相互关系[23]。本研究中，拜泉县3种林型的叶片除了有机碳含量差异不显著，混交林落叶松叶片全氮及全磷含量都显著高于混交林樟子松，落叶松纯林叶片碳氮比则显著高于其他林型叶片（P＜0.05）。混交林落叶松叶片的碳、氮、磷含量均大于落叶松纯林，而其叶片碳氮比则表现出与前者相反的趋势，这与朱潮等[24]对兰州北山侧柏人工林的研究结果一致。有阈值试验表明，当叶片氮磷比小于14时，植物生长主要受氮含量限制[25]，本研究中叶片氮磷比均小于14，说明该区域植物生长总体上受自身氮元素限制。由于植物碳同化和营养元素吸收的途径不同，在自然条件下，一般认为碳不会限制植物的生长，因此氮和磷含量的变化是影响碳氮比和碳磷比的主要因子[26]，这与本研究中叶片的全氮和全磷含量分别与其自身碳氮比、碳磷比及氮磷比呈显著负相关关系的结果一致。本研究中叶片全磷含量与土壤有机碳含量、土壤碳磷比都呈显著正相关关系（P＜0.05）（见表5）。面对磷资源短缺和土壤磷限制正在威胁着植物和粮食安全的情况，有研究对不同种植物叶片磷含量与土壤养分指标进行分析，发现植物叶片全磷含量与土壤全磷含量、植物叶片全氮含量与土壤全氮含量之间都没有显著相关性[27]，与本研究结果相符。

4 结 论

1）混交林落叶松叶片氮、磷含量及土壤碳、磷含量都高于其他林型及树种，表明混交林落叶松优势度较高；3种林型叶片氮磷比均小于14，土壤全磷含量均低于全国森林平均磷含量，表明植物生长一定程度上受到了叶片氮元素及土壤磷元素的限制。

2）RDA分析得知，土壤硝态氮含量对土壤的影响最大，且ITS、、Acidobacteria、phoD这3种基因拷贝数与其呈显著正相关关系（P＜0.05），此外这3种基因也均与土壤有机碳、全磷、速效磷含量和碳氮比等呈正相关关系，混交林两树种土壤的这3种基因拷贝数均高于纯林树种，说明土壤理化指标及化学计量比在不同程度上影响了土壤中功能基因拷贝数，且混交林植物生长优于纯林。

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收稿日期： 2022-10-08

基金项目： 林业公益性行业科研专项（201404202-01）

第一作者：李德文（1981—），女，黑龙江鸡西人，教授，博士，主要研究方向为植物生态学。

通信作者：刘英（1978—），女，辽宁大连人，副教授，博士，主要研究方向为植物生态学。

E-mail： 1610311466@qq.com

（责任编辑 徐素霞）