高效液相色谱法对土壤中抗生素残留检测研究

颜 洁,张群英

(1.贵州省检测技术研究应用中心,贵州 贵阳 550002;2.贵州省植物园,贵州 贵阳 550001)

抗生素类药物可长时间存在于土壤中不被降解,部分抗生素随着水流渗透到地下和地下水,造成水质污染,最终对人的身体健康造成伤害。为降低抗生素对环境的影响,对土壤中抗生素进行检测非常必要,这就需要建立一种新检测方法弥补原来检测方法中准确度不高的缺陷。本次实验以养殖场周围的土壤作为实验的材料对两类抗生素进行研究。选择4种喹诺酮类抗生素以及2种磺胺类的抗生素作为主要检测目标,再利用超声波进行辅助提取,以提高样品中目标物质的回收率,提取后的样品用高效液相色谱仪进行检测。

1 实验部分

1.1 实验材料及试剂

本次实验研究样品来自鱼场周围的土壤。主要实验仪器如下：Waters高效液相色谱仪,美国Waters公司;DN-24W恒温水浴氮气吹干仪,上海比朗仪器制造有限公司;KQ5200E型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;德国IKA VORTEX 涡旋混匀器,广州仪科实验室有限公司;电子天平JY10002,上海舜宇恒平有限公司;Oasis HLB固相萃取柱,美国Waters公司;TG16.5台式高速离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司。

实验试剂及标准品：一水合柠檬酸,分析纯;无水磷酸氢二钾,分析纯;乙腈,化学纯;甲酸,色谱级;乙二胺四乙酸二钠盐,分析纯;乙二胺四乙酸,分析纯;甲醇,分析纯;氨水,优级纯。抗生素标准品：磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星,纯度>98%,上海源叶生物科技有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1标准储备液

分别称取0.01 g的6种抗生素环丙沙星、磺胺嘧啶、恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和磺胺甲噁唑抗生素到10.0 mL烧杯中,用少量甲醇溶解后转移到10.0 mL容量瓶中,用甲醇清洗烧杯2～3次;清洗后的甲醇也转移到该容量瓶中,然后用甲醇定容至刻度,混合均匀,配成1 g/L的标准储备液,于-20 ℃的冰箱中保存,有效期3个月。

1.2.2流动相

0.1%甲酸溶液：在1 L的容量瓶里准确加入1.0 mL纯度>99%的甲酸,用超纯水定容至刻度,混合均匀,用0.22 μm的水系膜过滤。

1.2.3提取液

0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲液：在325 mL的纯水中加入称取好的4.2 g的柠檬酸和8.95 g的磷酸二氢钾,混合充分之后用盐酸(或氢氧化钠)调节pH值到4.0±0.05。加入12.1 g的乙二胺四乙酸二钠盐,制成的325 mL浓度0.1 mol/L的EDTA-Mcllvaine缓冲液。

1.3 实验方法

1.3.1实验前处理

毛泽东在吸收和发展湖湘学派“力行第一”知行观的基础上，非常注重对各种理论的实践与力行，这在他的一生都得到比较充分的体现。在1920年，毛泽东创办文化书社，在湖南传播新文化、新思想，使之不仅是一个传播马克思主义的机构，而且是建立共产党的一个秘密机构，为建立共产党做了巨大的贡献。在领导湖南自治运动失败后，毛泽东投入巨大的精力组建湖南社会主义青年团和长沙共产主义小组，把青年团创建同党的创建紧密联系在一起。深入农村，在充分调查了解之后创作了《湖南农民运动调查报告》，领导秋收起义等。

喹诺酮类土壤样品预处理：在50 mL离心管中加入0.5 g的样品土样,再加入4 mL乙腈、0.7 mL 20%氨水溶液以及0.3 mL 10%EDTA溶液,盖好离心管盖,将离心管涡旋30 s;然后放入超声清洗器中超声提取10 min,取出放入离心机中以4 000 r/min的速度离心6 min。将离心管的上层清液收集起来对残留物再一次地提取之后合并上层的清液,再在40 ℃的氮气吹干仪中将其氮吹到近干,将试管倒扣后不会有液体流出即可。然后加入0.5 mL的原始流动相,用注射器取出注射到0.22 μm滤膜上后用机器分析结果。磺胺类土壤样品预处理：在50 mL离心管中加入0.5 g的样品土样,再加入体积比为1∶1的甲醇和5 mL EDTA-Mcllvaine的混合溶液进行溶解。将离心管涡旋30 s,然后放入超声清洗器中超声提取10 min,取出放入离心机中以4 000 r/min的速度离心6 min。将离心管的上层清液收集起来对残留物再一次的提取之后,合并上层的清液并浓缩至5 mL。用6 mL甲醇和6 mL纯水活化柱子,再将5 mL浓缩液过HLB小柱,分别用6 mL超纯水和3 mL甲醇进行洗脱,再将洗脱好的溶液收集到试管当中。再在40 ℃的氮气吹干仪中将其氮吹到近干,将试管进行倒扣后不会有液体流出即可。最后用0.5 mL的甲醇与纯水6∶4的混合液进行定容,然后用注射器取出注射到0.22 μm滤膜上后用机器分析结果。

1.3.2色谱条件

喹诺酮类抗生素液相色谱条件：色谱柱,ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm);柱温,35 ℃;流速,0.3 mL/min;进样量,10 μL;流动相,0.1%甲酸水溶液-乙腈(87∶13)。

磺胺类抗生素液相色谱条件：色谱柱,ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm);柱温,35 ℃;流速,0.3 mL/min;进样量,10 μL;检测波长,270 nm;流动相,0.1%甲酸水溶液-乙腈(80∶20)。

2 结果分析

2.1 前处理方法优化

2.1.1提取液的选择

实验中在对喹诺酮类的药物进行提取时比较了纯乙腈提取液(M1)和乙腈与EDTA溶液和氨水混合液提取液(M2)两种提取液对抗生素的回收率所产生的影响。在抗生素中加入两种提取液各5 mL然后进行实验。结果见表1。

表1 不同提取剂对抗生素的添加回收率

从表1可以看出,两种提取液的差别,其中M2的提取液效果要比M1好很多,并且由于同极斥的原理,喹诺酮类药物在与土壤进行反应后也是互相排斥的,且更容易在土壤中进行分离,所以M2的效果更优于M1。

2.1.2浓缩方法的优化

2.1.3提取操作和次数的优化

实验中采用了超声波提取并涡旋了两种溶液,能够看出操作时间对于两种磺胺类药品回收率是有一定影响的,同时也对提取次数的提取效果进行了对比。实验结果见表2。

表2 不同提取方法对2种磺胺类药物的添加回收率

由表2可知,超声和涡旋组合提取能够明显提高药品回收率,采用涡旋法能够将试剂与沉积在离心管下面的药物进行充分且均匀的混合,而超声的时间长短对于药品的回收率来说并没有特别明显的影响。虽然超声10 min加上涡旋30 s的组合提取时间是最短的,但是效果却是最好的,对于实验的效率提升也非常明显。不同提取次数对抗生素的添加回收率见表3。

表3 不同提取次数对抗生素的添加回收率

由表3可知,提取3次的回收率最高,提取2次回收率与它并没有差很多,所以实验选择上会选择最具效率的方法,即超声10 min涡旋30 s,提取2次的前处理方式。

2.2 色谱条件的选择和优化

2.2.1检测波长的选择

6种抗生素在进行紫外线检测扫描时能够发现,在180～380 nm这个波长的区间进行全段扫描是最佳的。从参考文献中能够发现磺胺类的检测波长在265～272 nm,大多数选择270 nm作为最佳波长,喹诺酮类检测波长为278 nm,所以在进行选择时本实验选择了磺胺类检测波长为270 nm,喹诺酮类检测波长为278 nm。

2.2.2抗生素的高效液相色谱分离图

根据多次重复实验,得到最优分离检测的液相分离条件。各抗生素添加浓度为5 mg/L时液相色谱图见图1。

图1 六种抗生素的高效液相色谱分离图

2.3 方法学验证

2.3.1标准工作曲线

将标准储备液用空白样品溶液进行稀释,将其变成质量浓度分别为0.05、1、5、10、20 mg/L的标准溶液,分别进样,将工作溶液浓度作为横坐标,液相峰面积作为纵坐标绘制标准曲线,从而得到每个组份的线性关系。6种抗生素的线性方程及相关系数R2见表4。得到结果的相关系数都>0.99。

表4 4种氟喹诺酮和2种磺胺类抗生素的线性方程及相关系数

2.3.2准确度与精密度

称取0.5 g土壤样品3份,向其中分别加入1.0 mL 3种浓度(0.05、0.5、5 mg/L)的标准溶液,然后进行平行的3组实验,结果如表5所示。由表5可知,加标回收的平均回收率在71.8%～94.3%,而实验的相对标准偏差在0.9%～15.5%,所以该提取、检测的方法可行。

表5 6种抗生素在不同浓度下的平均回收率和相对标准偏差

3 结论

本文实验将土壤作为实验材料,将比较常见的6种抗生素作为实际的检测对象,通过对实验数据分析可得到以下结论：①高效液相色谱技术对4种喹诺酮类药物的检测,流动相采用0.1%甲酸水和

乙腈(87∶13)作为液相条件。结果发现,4种抗生素完全分离只需要5 min,每个组的浓度和峰面积之间具有良好的线性关系,相关系数均>0.99,抗生素的标准偏差在1.3%～15.4%。②高效液相色谱技术对2种磺胺类进行检测,流动相采用为0.1%甲酸水和乙腈(80∶20)作为液相条件。结果发现,4种抗生素完全分离需要3 min,每组的浓度和峰面积之间呈现良好的线性关系,相关系数均>0.99,抗生素的相对标准差在0.9%～15.5%。③本实验对于土壤中6种抗生素不同的浓缩方法对回收率影响进行研究,发现氮气浓缩为最佳方法,虽然耗时长,但是损耗低,峰型也好。