小儿参术健脾丸质量标准提升研究

姜 旭，赵跃东，梁娟娟，杨晓宁△，董媛媛，孙路萍，朱 平

（1. 北京振东光明药物研究院有限公司，北京 100085； 2. 山西振东五和堂制药有限公司，山西 长治 046108）

小儿参术健脾丸现收录于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第5 册）》（WS3- B - 0892- 91），由党参、白术、山楂、陈皮等13 味中药材组方，具有开胃、健脾、止泻功效，用于小儿脾胃虚弱、消化不良、面黄肌瘦、精神不振的治疗。现有质量标准中仅有其性状和显微鉴别，且缺乏药味归属的说明，质量可控性差。为响应国家药品监督管理局提高儿童药质量的要求，本研究中对制剂中单味药材进行了显微鉴别，完成药味确认与归属，建立了部分药味的薄层色谱鉴别（TLC）法，增加了橙皮苷定量测定的高效液相色谱（HPLC）法，进而提升小儿参术健脾丸的质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000 型液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；DM750型电子显微镜（德国Leica 公司）；TLC Vi⁃suaLizer 型薄层色谱数码成像系统（瑞士Camag 公司）；KQ - 500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME - 204 型电子分析天平（梅特勒- 托利多国际贸易<上海>有限公司）。

1.2 试药

小儿参术健脾丸（山西振东五和堂制药有限公司，批号分别为20200809，20200914，20200915）；橙皮苷对照品（批号为110721-202019，含量95.3%），白术对照药材（批号为120925-202013），陈皮对照药材（批号为120969 - 202011），山楂对照药材（批号为121138 -201206），甘草对照药材（批号为120904 - 202021），均购自中国食品药品检定研究院；茯苓（安徽家和中药科技股份有限公司，批号为Y2010018）；党参（山西振东道地药材开发有限公司，批号为Y2010015）；山楂（阳城县益农土地流转农民专业合作社，批号为Y2006003-6）；（土炒）白扁豆（安徽美誉中药饮片有限公司，批号Y2006018-1）；（麸炒）六神曲（安徽守信中药科技有限公司，批号为Y2009004）；（蜜炙）甘草（河北智嘉药业有限公司，批号为Y2007036）；硅胶G 薄层板（烟台新诚硅胶材料有限公司）、聚酰胺薄层板（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂），规格均为10 cm×10 cm；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取样品适量，用温水溶解，去除红糖和蜂蜜，取干燥后药渣，置显微镜下观察，并与对照药材粉末显微特征进行比对。不规则分枝状团块无色，遇水合氯醛液溶化；茯苓菌丝无色或淡棕色，直径为4～6µm；党参联结乳管直径为12～15 µm，含细小颗粒状物；山楂果皮石细胞单个散在或少数成群，淡紫红色、红色或黄棕色，类圆形或多角形；白扁豆种皮栅状细胞长80～150µm；甘草纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维。详见图1。

图1 显微特征图Fig.1 Microscopic identification

2.2 TLC 鉴别

白术：取样品10 丸，剪碎，加乙醚50 mL，回流提取1 h，滤过，药渣备用，滤液浓缩蒸干，加0.5 mL 乙酸乙酯溶解，即得供试品溶液。取白术对照药材0.5 g，精密称定，加乙醚20 mL，超声（功率500 W、频率40 kHz，下同）处理15 min，滤过，滤液浓缩蒸干，加1 mL 乙酸乙酯溶解，即得对照药材溶液［1］。按小儿参术健脾丸处方和工艺制备缺白术的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，吸取上述溶液各10µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯（10∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视［2］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图2 A。

图2 薄层色谱图Fig.2 TLC chromatograms

山楂：取山楂对照药材0.5 g，精密称定，加乙酸乙酯10 mL，超声处理15 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，即得对照药材溶液。按小儿参术健脾丸处方和工艺制备缺山楂的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法试验，吸取上述溶液及白术鉴别项下供试品溶液各5µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20∶5∶8∶0.1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视［2-3］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。详见图2 B。

陈皮：取白术鉴别项下备用药渣，加甲醇50 mL，超声提取30 min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加水20 mL使溶解，通过D101 型大孔吸附树脂（内径为1.5 cm，柱高为20 cm），依次用水、30%乙醇、50%乙醇各100 mL洗脱，收集30%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，即得供试品溶液。收集50%乙醇洗脱液，备用。取陈皮对照药材0.5 g，精密称定，加甲醇15 mL，超声提取30 min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得对照药材溶液。按小儿参术健脾丸处方和工艺制备缺陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法试验，吸取上述溶液各2µL，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇（5∶1∶1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯（365 nm）下检视［2］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。详见图2 C。

甘草：取陈皮鉴别项下备用50%乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取甘草对照药材0.5 g，精密称定，加甲醇15 mL，加热回流30 min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，即得对照药材溶液。按小儿参术健脾丸处方和工艺制备缺甘草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法试验，吸取上述溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯（365 nm）下检视［2，4］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。详见图2 D。

2.3 橙皮苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液（18∶82，V/V）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.3.2 溶液制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20µg的对照品溶液。取样品（剪碎，混匀）约1 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，用甲醇补足缺失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按小儿参术健脾丸处方及制备工艺制备缺陈皮的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

系统适用性试验与专属性试验：精密吸取2.3.2项下3 种溶液各10µL，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液相应位置有色谱峰，理论板数按橙皮苷峰计应不低于2 000［5-7］，分离度均大于1.5，阴性对照无干扰。详见图3。

图3 高效液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms

线性关系考察：取2.3.2 项下对照品溶液适量，加甲醇制成质量浓度为100µg/mL 的溶液，倍比稀释，制成不同质量浓度的系列对照品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，µg/ mL）为横坐标，以橙皮苷峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y= 0.305X- 0.014 4（r=0.999 9）。结果表明，橙皮苷质量浓度在4.898 4～48.984 2µg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.3.2 项下供试品溶液适量，按2.3.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果橙皮苷峰面积的RSD为0.23%（n= 6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取2.3.2项下对照品溶液和供试品溶液各适量，分别于室温下放置0，2，4，8，16，24 h 时按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果橙皮苷峰面积的RSD分别为0.65%和0.48%（n= 6），表明对照品溶液和供试品溶液室温下放置24 h 内基本稳定。

重复性试验：取样品适量，精密称定，共6 份，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算橙皮苷含量。结果的RSD为1.25%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批已知含量的样品适量，精密称定，平行9份，加入一定质量浓度的对照品溶液，按2.3.2 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.3.4 样品含量测定

取3批样品各适量，精密称定，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，结果3批样品中橙皮苷含量分别为1.20，1.19，1.20 mg/g。

3 讨论

显微鉴别法是中药原粉入药常用质量控制手段之一，本研究中通过鉴别小儿参术健脾丸的显微特征，对现有质量标准中的显微特征进行确认和归属，发现原有质量标准中栅状细胞结构不仅在白扁豆中存在，也在六神曲（含赤小豆粗粉）中存在，其显微结构专属性不强，有待讨论和确定。中药原粉入药的显微鉴别有助于避免含相同化学成分含量控制的中药材混用，保证药品的质量。

TLC法和HPLC法具有操作方便、检测速度快、灵敏度高等特点，广泛应用于药物分析［8-15］。优化上述2种方法的条件后，建立了小儿参术健脾丸中白术、陈皮、山楂、甘草的TLC 鉴别方法和橙皮苷的含量测定方法。通过同一份样品同一制备方法中的不同产物，即可完成处方中4 个药味的TLC 鉴别，操作简单可行，有效节约了样品用量，减少了有机溶剂种类，简化了烦琐的操作。结果4种药材薄层特征明显，分离度高，阴性对照无干扰，专属性强。建立的橙皮苷含量测定方法，精密度、重复性佳，回收率高。

综上所述，本研究中所建立的方法可靠，重复性好，可为小儿参术健脾丸质量标准的修订提供参考。