Box-Behnken 响应面法优选柴银颗粒中挥发油提取工艺*

黄孟秋，邱荣英，李因坤，李 倩，杜昊忱△

（1. 鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006； 2. 中药制药共性技术国家重点实验室<鲁南制药集团>，山东 临沂 276006； 3. 山东新时代药业有限公司，山东 临沂 276006）

柴银颗粒为《伤寒六书》中的柴葛解肌汤和《温病条辨》中的银翘散化裁而成，由柴胡、金银花、黄芩、葛根、荆芥等11味中药组方，能清热解毒、利咽止咳，治疗发热恶风、咳嗽、咽喉肿痛、鼻塞流涕、头痛等的效果良好［1-3］。方中柴胡、金银花、荆芥、薄荷、鱼腥草、青蒿及连翘7 味药材均含丰富的挥发性成分，具有发汗解热、抗炎、抗菌、抗病毒等多种药理活性［4-11］，但其性质不稳定，长时间高温提取易造成有效成分损失，故柴银颗粒在制剂生产中会优先提取挥发油［12］。中药挥发油提取方法包括水蒸气蒸馏法、超临界流体萃取法、微波提取法等。其中水蒸气蒸馏法具有操作简便、效率较高等优点，适用于工业化大生产［13-15］。本研究中采用水蒸气蒸馏法对7 味药材中挥发油的提取工艺进行探讨，采用Box-Behnken响应面法优选最佳提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ML6002T/ 02 型电子天平（梅特勒- 托利多仪器< 上海> 有限公司，精度为0.01 g）；挥发油提取器（南京康洛达实验科技有限公司）；KDM 型控温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）。

1.2 试药

柴胡（批号为4597210010）、金银花（批号为453021033）、薄荷（批号为452421008）、连翘（批号为453121020）的药材饮片，均购自山东百味堂中药饮片有限公司；荆芥（批号为452721002）、青蒿（批号为452828007）、鱼腥草（批号为452621005）的药材饮片，均购自安徽人民中药饮片有限公司。上述药材饮片样品均由中药制药共性技术国家重点实验室（鲁南制药集团）范建伟高级工程师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 挥发油提取

根据柴银颗粒处方及工艺，按0.4 倍处方量称取柴胡100 g，金银花、青蒿、连翘、薄荷、鱼腥草各75 g，荆芥50 g，置圆底烧瓶中，加适量饮用水（下同），浸泡，连接挥发油提取器及上方冷凝管，置控温电热套中加热至沸腾，并保持微沸状态，收集挥发油，测定挥发油提取量。

2.2 单因素试验

浸泡时间：按2.1 项下方法，设定加水量为10 倍量，提取时间为3 h，浸泡时间分别为0，0.5，1.0，1.5，2.0 h。结果见图1 a。可见，浸泡时间在0～0.5 h 范围内，挥发油提取量随提取时间的延长而增多，0.5 h时达最大值；在0.5～2.0 h 范围内，挥发油提取量总体下降。故浸泡时间选择0～1.0 h。

图1 单因素试验结果Fig.1 Results of the single factor test

加水量：按2.1 项下方法，设定浸泡时间为0.5 h，提取时间为3.0 h，加水量分别为6，8，10，12，14 倍。结果见图1 b。可见，加水量在6～10 倍范围内，挥发油提取量随加水量的增加而增多，加水量为10 倍量时达最大值；在10～14 倍范围内，挥发油提取量总体下降。故加水量选择8～12倍。

提取时间：按2.1项下方法，设定浸泡时间为0.5 h，加水量为10 倍，提取时间分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h。结果见图1 c。可知，提取时间在1.0～4.0 h 内，挥发油提取量随提取时间的延长而增多，4.0 h 时达最大值；在4.0～5.0 h 内，挥发油提取量总体下降。故提取时间选择3.0～5.0 h。

2.3 Box - Behnken 响应面试验

试验设计与结果：在单因素试验基础上，采用Design - Expert 13 软件，以浸泡时间（因素A）、加水量（因素B）、提取时间（因素C）为考察因素，以挥发油提取量为评价指标，进行Box-Behnken 响应面试验。因素与水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and their levels

表2 Box-Behnken试验设计与结果Tab.2 Design and results of Box-Behnken test

模型拟合与方差分析：对表2中的试验结果进行模型拟合，以各因素为自变量，以挥发油提取量（Y，mL）为因变量，可得回归方程Y=2.63+0.123 6A+0.052 3B+0.136 2C+ 0.102 0AB- 0.045 0AC- 0.062 5BC-0.140 2A2-0.246 9B2-0.144 9C2。方差分析结果（表3）显示，该模型F值为42.19，P<0.000 1，表明该模型有显著差异；且失拟项P=0.624 1>0.05（不显著），表明模型建立成功。回归方程R2=0.98，该模型对试验数据的拟合情况较好；决定系数R2Adj=0.96，与实测值相差较小，表明模型可行性较高；变异系数为1.97，信噪比为17.73，表明模型具有较高的准确度和可信性。对挥发油提取量的影响大小顺序为因素C>因素A>因素B。

表3 方差分析结果Tab.3 Results of the ANOVA

响应面图与等高线分析：分别以因素A、因素B、因素C 为响应因子，以挥发油提取量为响应值，绘制响应面图及等高线图（图2）。初步得到挥发油最佳提取工艺为浸泡0.83 h，加9.9 倍量水，提取4.6 h。在此条件下，挥发油提取量预测值为2.66 mL。结合实际工业生产条件，对预测的工艺参数进行微调，最终确定挥发油最佳提取工艺为浸泡1.0 h，加10倍量水，提取4.0 h。

图2 各因素间交互作用的响应面图及等高线图Fig.2 Response surface diagrams and contour diagrams of interaction among various factors

2.4 验证试验

按2.1项下方法，根据上述最佳提取工艺进行验证试验，平行3 次。结果挥发油提取量分别为2.63，2.57，2.61 mL，平均（2.60±0.03）mL，RSD为1.17%（n=3），实测值与预测值的均方误差为0.001 3。提示方程与真实试验拟合较好，优选的工艺稳定可行。

3 讨论

柴银颗粒对上呼吸道感染初期伴有的发热、咽痛、乏力等症状具有一定疗效，方中柴胡、金银花、荆芥、青蒿、连翘、薄荷、鱼腥草的挥发性成分具有发汗解表、清热解毒功效。目前，已有报道对柴胡、金银花、青蒿等单味药材中挥发油的提取工艺进行了研究［16-18］。

本研究中单因素试验结果表明，浸泡时间、加水量及提取时间对挥发油提取量的影响均呈先升高后降低的趋势。这是由于在提取挥发油过程中，分子处于动态变化，提取时间、浸泡时间及加水量不足，不利于挥发油提取完全；提取时间和浸泡时间过长或加水量过多可能会影响挥发油分解与转化，进而降低收率。本研究中通过Box- Behnken 响应面法拟合了浸泡时间、加水量、提取时间与挥发油提取量之间的函数关系，方差分析结果表明，3 个因素均对制剂中挥发油的提取量有显著影响，其中提取时间影响最显著。根据Box-Behnken响应面法试验结果，考虑到能源消耗等问题，最终确定柴银颗粒中挥发油的最佳提取工艺为浸泡1.0 h，加10 倍量水，提取4.0 h，可为柴银颗粒工业化生产提供参考。

挥发油提取是中药提取的重要步骤，对药物疗效有重要影响。但目前部分标准中柴银颗粒含量测定的指标性成分为黄芩苷，挥发性成分大多仅作定性鉴别，不利于全面控制柴银颗粒的质量。故在后续研究中可采用气相色谱-质谱联用法等分析柴银颗粒挥发油中的主要成分，建立相应的含量测定方法，为提升制剂质量和完善其评价标准提供参考。