外源独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗生长的缓解效应

史沉鱼，吴梁艳

（河池学院化学与生物工程学院，广西宜州 546300）

不利的外部条件，如干旱和高盐度，会对植物的生长产生不利影响。土壤盐碱化是影响植物生长发育的主要非生物因素之一。植物生长发育过程中对外界环境的变化非常敏感，在不利的环境下，植物会通过调控自身生理生化指标、体内激素水平及胁迫响应基因的变化等多种途径来抵抗逆境[1]。盐胁迫是土壤中盐离子特别是Na+和Cl-的过量积累，严重影响植物的正常生长发育[1]。植物的耐盐机理涉及方面较多，其中生理水平的自我调节是植物体表现出耐盐特性的主要机制[2]。研究发现，施加外源激素可以降低Na+、Cl-在细胞中的含量。当植物遇到紧急胁迫时，最直接有效地缓解胁迫危害的一种方式就是喷施外源物质。

黄瓜（Cucumis sativusL.）系葫芦科黄瓜属植物，广泛种植于温带和热带地区[3-4]。黄瓜是一种非盐生植物，根浅，相对脆弱，对盐胁迫等刺激很敏感[5]。非盐生植物在胁迫下的生长发育受到显著抑制。有研究表明，不同浓度的NaCl处理对黄瓜幼苗生长的影响表现各不相同。低度胁迫对植株的生长和各生理指标影响较小；中度胁迫下植株生物量下降表现明显，1.2%达到植株生长的极限盐浓度[6]。盐胁迫能够严重影响黄瓜幼苗的正常生长，如植株的株高、叶片面积、地上部分鲜重、总根长度等都会降低。研究发现NaCl胁迫对黄瓜幼苗地上部分和根系的影响稍有区别，盐胁迫会降低CAT、POD、SOD 等抗氧化酶的活性，细胞膜的透性受到影响，导致细胞的代谢不正常；盐胁迫程度加重，植物细胞受到的伤害也越大[7]。在盐胁迫下，气孔或非气孔因素是影响作物光合作用的主要因素，其中影响气孔的因素包括光、CO2、气孔振动、植物激素及其他[8]；高盐会导致作物叶片气孔关闭，光合速率降低[9]。

独脚金内酯(strigolactones，SLs)是一类萜类小分子化合物，广泛存在于植物界中[10]。独脚金内酯是一些天然独脚金醇类化合物及人工合成类似物的总称，现已被公认为第七大植物激素，可作生长调节剂[11]。SLs主要在根中合成，茎、芽等组织中合成量极低[12]。现已从植物根系分泌物中分离和鉴定出约20 种天然SL，此数量还会继续增加[13]。独脚金内酯合成途径中的关键基因有D27、D17和D10[14]。目前在独脚金内酯生物学功能的科学研究中被广泛应用的是GR24。如在拟南芥突变实验中，施加GR24 能明显改善突变体对干旱和盐害胁迫的抵抗能力[15]。外施SLs 在一定程度上会增加CAT、POD、SOD 等抗氧化酶的活性，抑制H2O2和MDA 的产生，抗氧化酶活性越高，对盐胁迫的适应性越强[16]。近年来，研究发现SLs 在植物干旱、盐、营养缺乏等非生物胁迫响应中发挥关键作用[17]，调节独脚金内酯代谢相关基因的表达有助于植物的生长发育和抗逆性的变化[18]。然而独脚金内酯在植物生长发育多个方面的调控作用还不明确，特别是其对盐胁迫下植物生理特性的影响还有待进一步研究。本试验以黄瓜幼苗为对象，研究外源独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗的种子萌发、幼苗渗透调节物质含量和抗氧化酶活性等生理指标的影响，分析评价高盐对植物的影响程度，为盐胁迫下黄瓜生理生长的缓解效应提供理论支持，对蔬菜的安全生产和保障人体健康具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

试验材料为津绿11号黄瓜。试剂有独脚金内酯人工合成类似物（GR24）、NaCl、丙酮、95%乙醇、石英砂、碳酸钙粉末、氮蓝四唑（NBT）、EDTA-Na2、磷酸缓冲液、乙酸乙酯、牛血清蛋白、甲硫氨酸（Met）、考马斯亮蓝G-250、蒽酮、核黄素、愈创木酚。试验仪器有分光光度计、电子天平、显微镜、恒温水浴锅、离心机等。

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发及幼苗培养

首先选取籽粒饱满、大小一致的黄瓜种子，在烧杯中准备适量的水，将种子浸泡进去，保证水能没过种子，大概5～6 h 后将种子捞出，在铺有滤纸的培养皿中将种子铺平整，进行催芽，2 d 后将其种到土里。共设5 个处理，每个处理6 盆，每盆5 株。在27～30 ℃温度中培养，待黄瓜幼苗长到两叶一心时按试验设计（见表1）进行处理。NaCl 溶液每2 d 浇1 次，共处理4 次，模拟盐胁迫环境。再分别配制浓度为0 nM、5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 溶液对盐胁迫组进行处理，将不同浓度的GR24 分装到小喷瓶中均匀喷在黄瓜幼苗叶片两侧，以叶面湿润不流滴为准；GR24喷施7 d后，分别取样进行各项生理指标的测定，3次重复。

表1 试验设计

1.2.2 生理指标测定方法

株高、根长、真叶数每个处理随机测量10株。

叶绿素含量用分光光度法，超氧化物歧化酶活性用氮蓝四唑（NBT）还原法，过氧化物酶活性用愈疮木酚法，可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝-G250 法，可溶性糖含量用蒽酮比色法[18]测定。气孔结构用显微镜观察，在上午8:00—12:00，每个处理观察5 个装片，每个装片观察3个视野。

1.2.3 数据处理

各处理组取3 次重复的平均值，用Excel 和SPSS软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 外源独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗外形指标的影响

由表2 可知，各处理黄瓜幼苗的真叶数之间不存在显著差异；黄瓜幼苗的根长虽有上升趋势，但未达到显著水平；采用单一盐胁迫处理组（CK2）黄瓜幼苗的株高比对照组（CK1）下降16.85%，达到显著差异，表明盐胁迫会使黄瓜的株高受到明显限制。当用5 nM、10 nM、50 nM 浓度的GR24 处理后，黄瓜幼苗的株高比盐胁迫组（CK2）分别上升了7.39%、11.53%、14.07%，可以看出，喷施GR24 可减轻盐胁迫对黄瓜幼苗株高的抑制作用。

表2 外源独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗株高、根长、真叶数的影响

2.2 外源独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗生理指标的影响

2.2.1 叶绿素

表3 显示，在只有盐胁迫（CK2）条件下，黄瓜幼苗的叶绿素和类胡萝卜素含量较对照组（CK1）呈减少趋势，表明盐胁迫限制了黄瓜幼苗叶绿素的生成。当用5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 喷施盐胁迫下的黄瓜幼苗时，黄瓜幼苗的叶绿素和类胡萝卜素含量都比盐胁迫下（CK2）有所提高，达显著差异（p＜0.05）。盐胁迫（CK2）下黄瓜幼苗的叶绿素a 含量较对照组（CK1）减少34.92%，在5 nM、10 nM、50 nM浓度GR24处理下黄瓜幼苗的叶绿素a含量比盐胁迫组（CK2）分别增加了33.41%、41.46%、51.49%；盐胁迫组（CK2）黄瓜幼苗的叶绿素b 含量较对照组（CK1）减少42.82%，5 nM、10 nM、50 nM 处理组黄瓜幼苗的叶绿素b 含量较盐胁迫组（CK2）分别增加了44.72%、59.68%、64.68%；盐胁迫组（CK2）黄瓜幼苗的总叶绿素含量比对照组（CK1）减少37.22%，5 nM、10 nM、50 nM 处理组黄瓜幼苗的总叶绿素含量比盐胁迫组（CK2）分别增加了36.41%、46.29%、54.98%；盐胁迫组（CK2）黄瓜幼苗的类胡萝卜素含量比对照组（CK1）减少33.11%，5 nM、10 nM、50 nM 处理组黄瓜幼苗的类胡萝卜素含量比盐胁迫组（CK2）分别增加了24.33%、31.42%、41.72%。结果表明，施加GR24 可以提高盐胁迫下黄瓜幼苗的叶绿素和类胡萝卜素含量。

表3 独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗叶绿素含量的影响 单位：mg·L-1

2.2.2 过氧化物酶

过氧化物酶（POD）与植物的很多生理活动都相关，在植物体内活性较高。如图1 所示，采用单一盐胁迫处理组（CK2）的黄瓜幼苗叶片的POD 活性比对照组（CK1）降低；当用5 nM、10 nM、50 nM 浓度的GR24 处理黄瓜幼苗时，叶片中过氧化物酶活性与盐胁迫组（CK2）相比呈先下降再上升的趋势。

图1 独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗过氧化物酶活性的影响

2.2.3 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）是一种抗氧化酶，可以保护细胞免受活性氧的伤害或减少损害，在活性氧清除系统中起着重要作用。图2所示，采用单一盐胁迫处理组（CK2）黄瓜幼苗叶片中的SOD 活性比对照组（CK1）低；5 nM、10 nM、50 nM 的GR24 处理组的黄瓜幼苗SOD活性呈上升趋势，且处理间存在显著差异（p＜0.05）。

图2 独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗超氧化物歧化酶活性的影响

2.2.4 可溶性蛋白

图3 所示，用单一盐胁迫组（CK2）的黄瓜幼苗叶片中可溶性蛋白含量较对照组（CK1）下降9.08%，达显著性差异（p＜0.05）；GR24 处理后，可以看到黄瓜幼苗叶片的可溶性蛋白含量有升高的趋势，达显著性差异（p＜0.05）；5 nM、10 nM、50 nM浓度的GR24处理下，黄瓜幼苗的可溶性蛋白含量分别提高了6.34%、10.41%、7.26%。

图3 独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗可溶性蛋白含量的影响

2.2.5 可溶性糖

如图4 所示，采用单一盐胁迫组（CK2）黄瓜幼苗叶片中的可溶性糖含量较对照组（CK1）下降42.22%，有显著性差异（p＜0.05）；与盐胁迫组（CK2）相比，GR24 处理后，黄瓜幼苗叶片中的可溶性糖含量有所提高，有显著性差异（p＜0.05）；5 nM、10 nM、50 nM 浓度GR24 处理下，黄瓜幼苗的可溶性糖含量分别提高了39%、66%、44.83%。

图4 独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗可溶性糖含量的影响

2.2.6 气孔

气孔是由一对保卫细胞包围的孔隙，作为植物与环境之间气体交换的通道。气孔控制水分蒸腾和CO2吸入[19]，它在植物生长过程中起着重要的作用。盐胁迫会导致气孔闭合。如图5 所示，在光学显微镜40 倍下观察，黄瓜表皮分布着很多气孔，气孔的形态、长度及开放程度都不相同，5 个处理下黄瓜气孔特征存在差异。

图5 独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗气孔结构的影响

表4 显示，采用单一盐胁迫处理组（CK2）黄瓜幼苗的气孔开口长度、气孔开口宽度比对照组（CK1）下降了18.73%、31.31%，有显著性差异（p＜0.05）；经不同浓度的GR24 处理后，黄瓜幼苗的气孔开口长度、开口宽度均有所提高，表明黄瓜在遭受盐胁迫时气孔开放受到影响，经不同浓度的GR24 处理后，气孔开放程度有所提高；气孔密度各处理组间虽存在差异，但未达显著水平。

表4 独脚金内酯对盐胁迫下黄瓜幼苗气孔开口长度、宽度及气孔密度的影响

3 讨论与结论

3.1 讨论

黄瓜幼苗对盐胁迫很敏感，盐胁迫下植株生长受到明显抑制，本试验中单一盐胁迫组（CK2）黄瓜幼苗的株高较对照组（CK1）显著下降，黄瓜的株高明显受到限制；用GR24 处理盐胁迫组的黄瓜幼苗株高有所提高，说明喷施GR24 能减轻盐胁迫对黄瓜幼苗株高的抑制作用。

叶绿素是光合作用所必需的，它是光合生物中的一种绿色色素，有叶绿素a、叶绿素b；类胡萝卜素在光合作用中也同样有着重要作用。盐胁迫（CK2）条件下，黄瓜幼苗的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素含量较对照组（CK1）都呈减少趋势，盐胁迫使黄瓜幼苗叶绿素、类胡萝卜素的生成受到影响；5 nM、10 nM、50 nM 浓度的GR24 处理后，黄瓜幼苗的叶绿素、类胡萝卜素含量发生变化，较CK2 组有所提高。

处于正常生长下的植物可以平衡自身活性氧（ROS）和自由基的生成与清除，两者很弱时，不会伤害细胞。但是当植物暴露在不利的外部条件如高盐、干旱和洪水等环境下时，平衡就会受到影响。SOD、POD 和CAT 是植物体内重要的清除活性氧的酶，它们的活性可以用来判断植物的耐盐性，抗氧化酶的活性高，说明植物对盐胁迫有较好的适应能力。一定程度的盐胁迫下，抗氧化酶活性在短暂时间内会有增加的趋势；胁迫程度过强时，超出植物的忍受范围，抗氧化酶的活性则可能会降低[20]。黄瓜光合产物的形成及正常的生长发育都受到盐胁迫的影响[21]。本试验中，施加NaCl 对黄瓜叶片造成胁迫作用，抑制了叶片中SOD、POD 等酶活性，这与杨爱峥、李志磊等人的研究结果一致[20]。而GR24 提高了盐胁迫下黄瓜幼苗叶片中的过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性，降低了盐胁迫对黄瓜幼苗造成的伤害。

研究表明，盐胁迫能够诱导植株耐盐相关基因的表达，促进蛋白质的合成和相关酶活性发生一系列的变化，调节体内相应的生理代谢[22]。盐胁迫会抑制蛋白质合成、加速蛋白质降解等，使蛋白质含量因为受到盐胁迫而降低。本试验中，NaCl胁迫下，黄瓜幼苗叶片中的可溶性蛋白含量明显下降，这与孙彤彤的研究结果一致[23]。经不同浓度的GR24 处理后，黄瓜幼苗叶片中的可溶性蛋白含量有所提高。

可溶性糖是一种能参与渗透调节的小分子物质，其可以通过降低细胞水势来抵抗胁迫环境[23]。本试验中，采用单一盐胁迫组（CK2）黄瓜幼苗的可溶性糖含量比对照组（CK1）显著下降，经不同浓度的GR24处理后，黄瓜幼苗的可溶性糖含量都有所提高。

叶片气孔是植物与外界环境之间水、气交换的重要通道。大量研究表明，盐胁迫和CO2浓度升高都会使气孔开度迅速缩小，甚至造成气孔密度降低[24]。当植物受到盐胁迫时，气孔可能会关闭。过高的含盐量会降低土壤中的渗透势，反之，植物细胞的渗透势会增加，使植物难以吸收水分和养分，严重情况下会导致细胞组织中的水分外渗。为了减少水分流失、防止脱水，植物关闭气孔而降低气孔导度。试验用单一盐胁迫处理组（CK2）的黄瓜幼苗气孔开口长度、气孔开口宽度比对照组（CK1）显著下降，经不同浓度的GR24 处理后，黄瓜幼苗的气孔开口长度、开口宽度均有所提高，黄瓜在遭受盐胁迫时气孔开放程度受到影响，经不同浓度的GR24 处理后，气孔开放程度有所提高，GR24能减轻盐胁迫对黄瓜幼苗的伤害。

3.2 结论

试验结果表明，盐胁迫下黄瓜幼苗的株高会降低，叶片中抗氧化酶（POD、SOD）活性和可溶性蛋白、可溶性糖含量等降低，叶绿素、类胡萝卜素含量都呈下降趋势，气孔开放程度也受到影响。而采用不同浓度的GR24 分别对盐胁迫下的黄瓜幼苗进行处理，黄瓜株高显著升高，气孔开放程度有所提高，叶绿素和类胡萝卜素含量增加，叶片中抗氧化酶（POD、SOD）活性及可溶性蛋白、可溶性糖含量均有所提高，表明喷施GR24能有效缓解盐胁迫对黄瓜幼苗的伤害。