猪胸膜肺炎放线菌分离鉴定与耐药性检测

吕凤禄，赵 欢

（1.北镇市动物疫病预防控制中心（动物卫生监督中心），辽宁 北镇 121300；2.北镇市农业综合行政执法队，辽宁 北镇 121300）

在猪养殖过程中，不同日龄猪的呼吸道疾病成为临床中的常见疾病，对不同阶段猪的感染率和死亡率均较高，尤其是对仔猪的危害较大。引起不同日龄猪的呼吸道疾病的病原有许多，如细菌性病原引起的呼吸道感染、病毒性病原引起的呼吸道感染、支原体性病原引起的感染及寄生虫性病原等[1，2]。相关研究表明，临床中以细菌性病原引起的呼吸道感染较为常见，细菌性病原主要包括副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌及支气管败血波氏杆菌链球菌等，尤其是猪胸膜肺炎放线杆菌最为常见，猪胸膜肺炎放线杆菌严重影响猪的健康生长、也是猪死亡的重要因素之一，且在临床中常以多种病原菌和病毒混合感染为主[3，4]。猪传染性胸膜肺炎是由不同流行血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌引起不同日龄猪的一种传染性细菌性呼吸道传染病，该病临床中以呼吸困难、血性纤维素性胸膜肺炎、坏死性肺炎为主要的病理变化，引起严重的呼吸道感染且呈现急性死亡，其死亡率高达70%以上，该病成为危害养猪业严重的细菌疾病，危害我国养猪业的发展，给养猪业造成严重的经济损失。近年来，在我国不同地区的养殖场中感染性胸膜肺炎的发病率有增无减，且呈上升趋势。因此，对猪胸膜肺炎放线菌的防控具有重要意义。许多相关研究表明，在临床中猪胸膜肺炎放线菌对临床中常用的药物会产生严重的耐药性，这给猪胸膜肺炎放线菌病的治疗带来一定困难，同时还威胁人们的健康[7]。本试验从采集的疑似患猪胸膜肺炎放线菌病的病料样品中分离得到65株猪胸膜肺炎放线菌病，进行耐药性清情况监测，为指导临床合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

2021 年—2023 年采集某地区规模化养殖场及散养户中疑似患猪胸膜肺炎放线菌病不同日龄猪的咽拭子、鼻拭子及死亡猪的肺脏组织170份。

1.2 细菌分离与培养

对采集的疑似患猪胸膜肺炎放线菌病不同日龄猪病料组织170份和样品组织（咽拭子、鼻拭子及死亡猪的肺脏）150份，在无菌条件下分别划线接种于THB平板（含NAD）37℃培养12～18 h 后，接种于THB 液体培养基（含NAD）进行纯化培养，参照革兰氏染色试剂盒说明书对纯化培养的分离菌株进行染色和显微镜观察；参考文献报道法取纯化后分离菌株划线接种于胰蛋白胨血琼脂平板培养基上再接种金黄色葡萄球菌后，37℃培养12～24 h 后观察是否有卫星现象，同时调整菌液浓度，对分离的细菌进行生化鉴定试验。

1.3 细菌PCR鉴定

在生工生物工程（上海）股份有限公司合成猪胸膜肺炎放线菌鉴定引物，鉴定引物的片段大小为418 bp，以临床分离菌株为模板用猪胸膜肺炎放线菌鉴定引物（5′-TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC-3′；5-CATATTTGATAAAACCATCCGTC-3′）对分离菌株进行PCR鉴定[8]。

1.4 药敏试验

将临床中分离的猪胸膜肺炎放线菌用K-B 药敏纸片法进行药敏试验，其菌株药敏试验的操作流程及判定结果参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013 年推荐的标准K-B纸片法，每1 种药物菌做3 个重复，取其平均值，记录每一株分离菌株的药敏试验结果，统计每株猪胸膜肺炎放线菌分离菌株的耐药性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

疑似猪胸膜肺炎放线菌分离菌株在THB 平板（含NAD）长出特征性菌落形态；革兰氏染色可见分离菌株成链状排列或者单个的红色短杆菌（见图1）。分离的菌株胰蛋白胨血琼脂平板培养基上出现典型的卫星现象（见图2）。株疑似猪胸膜肺炎放线菌的培养特性、形态学及生化特性结果与《伯杰细菌鉴定手册》中报道的基本一致，经过统计，65株分离菌株初步鉴定为猪胸膜肺炎放线菌。

图1 分离菌株革兰氏染色结果（1 000×）Fig.1 Gram staining results of isolated strains

图2 分离菌株的卫星现象Fig.2 Satellite phenomenon of isolated Strains

2.2 细菌PCR鉴定

65 株疑似猪胸膜肺炎放线菌分离菌株通过PCR 鉴定均扩增出大约为418 bp目的基因条带（部分分离菌株PCR 鉴定结果见图3），65株疑似猪胸膜肺炎放线菌的分离菌株从分子生物学水平上鉴定为猪胸膜肺炎放线菌。

图3 部分分离菌株PCR鉴定结果Fig.3 Some isolates were identified by PCR

2.3 耐药性分析

采用K-B 药敏纸片法检测65 株猪胸膜肺炎放线菌的耐药性。由表1 可知，临床中分离的65 株猪胸膜肺炎放线菌对磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素、新霉素、大观霉素、链霉素、阿莫西林、青霉素、红霉素、土霉素、氟苯尼考等10 种药物的耐药率在50.8%～100%，对其他8种药物的耐药率在6.2%～33.8%。

表1 耐药性检测结果Tab.1 Drug resistance test results

3 讨论与结论

国内外研究表明，猪胸膜肺炎放线菌病是猪养殖中主要的细菌性呼吸道传染病之一，猪胸膜肺炎放线菌主要包含19种致病血清型，如猪胸膜肺炎放线菌1型-19 型，猪胸膜肺炎放线菌不同血清型的流行性具有区域性，各个血清型的分离菌株具有不同的致病性，各个血清型的分离菌株之间无交叉免疫反应，目前没有有效的猪胸膜肺炎放线菌病疫苗进行预防，这也是导致猪胸膜肺炎放线菌在不同养殖场中广泛流行的因素之一[9]。猪胸膜肺炎放线菌在我国不同地区的养猪场中广泛分布与流行，应该引起注意，做好防控措施。本研究从采集的疑似患猪胸膜肺炎放线菌感染不同阶段猪病料样品组织170 份中分离到65 株猪胸膜肺炎放线菌，说明猪胸膜肺炎放线菌引起某地区规模化养殖场及散养户中不同阶段猪的呼吸道疾病的主要病原菌。因此，规模化养殖场及散养户应该注意猪胸膜肺炎放线菌病的综合防控。临床防治猪胸膜肺炎放线菌病过程中，不合理使用抗菌药物现象较多，导致耐药性产生，给治疗带来一定的困难[10，11]。采用K-B药敏纸片法检测65 株猪胸膜肺炎放线菌的耐药性，结果显示，从临床分离的65 株猪胸膜肺炎放线菌对磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素、新霉素等10 种药物的耐药率在50.8%～100%，对其他8 种药物的耐药率在6.2%～33.8%，表明从该地区养殖场分离的猪胸膜肺炎放线菌对常用药物产生不同的耐药性。因此，在临床治疗猪胸膜肺炎放线菌病时，应该合理使用抗菌药物，同时配合环境消毒，才能提高治疗效果。