PCR-RFLP检测安庆六白猪BPI基因第10外显子的多态性

陈博赫 郭江 朱杰 文利新 谭国华 刘杨 马海明

摘  要：为探讨安庆六白猪杀菌性/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability increasing protein）即BPI基因的遗传多态性，本研究通过PCR-RFLP方法，检测了BPI基因第10外显子在安庆六白猪上的多态性。结果表明，在安庆六白猪中，GT基因型为优势基因型，T等位基因是优势等位基因；推测安庆六白猪BPI基因的GT基因型可能具有较高的免疫力，为安庆六白猪的保种和选育提供了有益的资料。

关键词：猪；BPI基因；PCR-RFLP

中图分类号：S813.3 文献标志码：A       文章编号：1001-0769（2023）03-0048-02

杀菌性/通透性增加蛋白（bactericidal/permeability increasing protein，BPI）是最早在人多形核中性粒细胞的嗜天青颗粒中被发现的一种脂多糖结合蛋白，是中性粒细胞中的一种蛋白分子，具有抗微生物活性[1]。在动物机体免疫应答调节和抵抗病毒感染方面，BPI基因不可或缺；BPI基因的多态性与动物机体免疫力之间存在显著相关性。BPI蛋白是一种储存于中性粒细胞起抗感染作用的蛋白质，也被冠以“超级抗生素”的称号[2]。安庆六白猪俗名“六花猪”，属肉脂兼用性地方品种，全身被毛黑色，额部﹑尾端和四肢呈白色，故得“六白”之称。安庆六白猪具有抗病性强、耐粗饲的特性。

本试验采用PCR-RFLP法，先提取安庆六白猪基因组DNA，用特异性引物扩增BPI基因第10外显子，再选用HpaⅡ限制性内切酶对其扩增产物进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切位点的多态性，为筛选有效分子标记提供基础依据。

1  材料与方法

1.1 试验动物与主要试剂

试验动物：214头安庆六白猪的耳或尾组织。

主要试剂：琼脂糖凝胶电泳loading Buffer﹑分子量标记、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）、四溴乙烷（tetrabromoethane，TBE）、HpaⅡ限制性内切酶、PCR mix、溴化乙锭等。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取

氯化钠冲洗组织，组织剪碎后加蛋白酶K，经1％十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）裂解液裂解细胞和消化蛋白质，用苯酚-氯仿萃取，高速离心后弃上清液，保存DNA。

1.2.2 PCR-RFLP

設计扩增BPI基因第10外显子的引物序列，上游引物：5'-CCAAACATGGAGATGCAGTTC-3'，下游引物：5'-CAATGAATC AATGAGCACACC-3'。以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系（50 μL）为：PCR Mix 25μL，上下游引物各1.0μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL；PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s扩增35个循环；72 ℃后延伸5 min，  4 ℃保存。用限制性核酸内切酶HpaⅡ处理PCR扩增产物，酶切体系（16μL）为：PCR扩增产物4.0 μL，10×buffer 2.0 μL，HpaⅡ酶   0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2  结果与分析

2.1 PCR产物检测结果

取5 μL PCR产物，用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳检测。产物条带与预期大小一致，大小为445 bp。

2.2 PCR-RFLP分析结果

将PCR产物用限制性内切酶HpaⅡ进行酶切后，产生3种条带，分别为445 bp、304 bp、142 bp（图1）。根据条带组成确定基因型，分别为GG型（445 bp）、GT型（445 bp、304 bp、142 bp）和TT型（304 bp、142 bp）。

2.3 安庆六白猪BPI基因的基因型及等位基因频率

安庆六白猪BPI基因的基因型及等位基因频率见表1。结果表明，安庆六白猪的优势基因型为GT基因型，优势等位基因为T等位基因。

3  结果与讨论

本研究以214头安庆六白猪为研究对象，通过PCR-RFLP方法，对BPI基因第10外显子进行了多态性分析。结果表明，Ｔ是安庆六白猪的优势等位基因，共存在GG、TT和GT三种基因型，其中GT基因型频率更高，推测该基因型的安庆六白猪可能具有较高的免疫应答能力。

参考文献

[1] WEISS J，ELSBACH P，OLSSON I，et al．Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes[J]．Journal of Biological Chemistry，1978，253（8）：2664-2672.

[2] WIESNER J，VILCINSKAS A．Antimicrobial peptides： the ancient arm of the human immune system[J]．Virulence，2010，1（5）：440-464.