液相色谱-串联质谱法测定猪肝中沙罗拉纳的残留量及方法耐用性研究

夏玉吉，陈华凤，窦明理，武首薰，何 楠，王 毅*

（1.四川省食品检验研究院，四川成都 610097；2.国家市场监管重点实验室（白酒监管技术），四川成都 610097；3.四川大学，四川成都 610000）

兽药残留是目前食品安全监管的重要内容，液相色谱-串联质谱法灵敏度高，能够快速识别动物源性食品中的兽药残留，已广泛应用于食品安全监管。沙罗拉纳[1]是一类作用于γ-氨基丁酸受体的新型驱虫药[2]，与其他驱虫药相比，这类药物具有吸收迅速、作用时间长（可持续12 周）[3]、代谢率低的特点（半衰期为10～14 d[4]），容易在肉及肉制品中残留。肝脏是这类药物的主要代谢器官，且肝脏基质复杂，常规净化效果不佳，因此选择肝脏作为代表基质研究样品的前处理，建立液相色谱-串联质谱分析方法，并对方法的耐用性进行考察。

分析方法的耐用性是指分析方法对实验室一般不易控制或不能保持完全一致的微小条件变化的敏感性[5]。《化学分析方法验证确认和内部质量控制术语和定义》（GB/T 32467—2015）和《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）都对分析方法建立时开展耐用性试验有严格的要求，但这些标准中并未给出具体的试验方案，仅有的几篇文献也只报道了耐用性试验在重金属检测[6-8]以及气相色谱测定环境污染物等领域的应用，未见耐用性试验在液相色谱-串联质谱分析领域的报道。本试验首先建立沙罗拉纳的液相色谱-串联质谱分析方法，再以W.J.尤登教授的耐用性试验为基础，利用PASW Statistics 18 软件设计正交表，考察10 个微小影响因素对试验结果的影响，再运用t检验、因素差值与标准差比较等两种统计方法对耐用性试验结果进行评价。研究结果将为液相色谱-串联质谱领域开展耐用性试验的因素选择、方案设计提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦1290/6460 液相色谱- 串联质谱仪，电子天平XS105DU，高速离心机HERAEUS MULTIFUGE X3R，涡旋混合仪 IKA MS 3。

沙罗拉纳标准品，浓度为100 μg·mL-1；甲醇、乙腈、甲酸铵均为色谱纯；PRiME HLB 固相萃取柱150 mg/3 mL；阴性猪肝样品。

1.2 色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流 动 相A 为5 mmol·L-1甲酸铵水，流动相B 为甲醇，洗脱程序梯度为0 ～2.0 min，体积分数为70%的甲醇；5.0 ～7.0 min，体积分数为90%的甲醇；7.1 ～10.0 min，体积分数为70%的甲醇，流速为0.3 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样体积为2 μL。

质谱参数如下。大气压电喷雾离子源（API-ESI）；MRM 模式；干燥气温度：350 ℃； 干燥气流量：5 L·min-1；雾化气压力：45 psi；鞘气温度：300 ℃；鞘气流量：11 L·min-1；毛细管电压：3.5 kV；喷嘴电压：500 V；增益电压：300 V。MRM 测定参数为正模式，母离子（m/z）581，定量离子（m/z）444，定性离子（m/z）416，去簇电压均为150 V，碰撞能量均为15 V。

1.3 试验方法

准确称取均质后的样品2.00 g 至50 mL 具塞离心管内，加入10 mL 乙腈，涡旋1 min，超声15 min，10 000 r·min-1离心5 min，取上层清液过PRiME HLB 固相萃取小柱，收集流出液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 甲醇定容，过0.22 μm 有机微孔滤膜，直接注入液相色谱-串联质谱仪，在仪器工作条件下进行测定。

1.4 耐用性实验方案

1.4.1 因素选择

本次试验主要考察10 个微小因素（用A～J表示），每个因素设计了两个水平，利用PASW Statistics 18 软件设计正交表（表1）。

表1 耐用性试验因素水平设计

1.4.2 检测编号组合

将考察的10 个因素，按表2 的编号组合进行安排。

表2 检测编号组合

1.4.3 具体检测方案

按照表2 的测试编号组合，共做12 次检测。每次检测的条件见表3。

表3 检测编号及条件组合

1.4.4 检测分工

实际检测样品是在阴性猪肝中添加固定浓度水平的标准品制得，上机测试液中沙罗拉纳浓度约为100 ng·mL-1（10 倍定量限水平）。两个人员的检测分工见表4。

表4 测试人员分工安排

2 结果与分析

2.1 样品预处理条件的选择

2.1.1 超声提取时间

提取环节，试验考察了超声提取10 min、15 min、20 min 3 种情况，考察结果以阴性样品在定量限水平的加标回收率表示，结果见表5。结果表明，超声提取15 min，沙罗拉纳加标回收率最高。

表5 不同超声提取时间优化结果

2.1.2 固相萃取小柱选择

针对复杂基质猪肝，前处理净化环节重点考察了固相萃取小柱及提取液，有3 种组合形式见表6，考察结果以阴性样品在定量限水平的加标回收率表示，结果见表6。

表6 固相萃取小柱及配套取液优化结果

结果表明，以乙腈作提取液过PRiME HLB 小柱，提取净化效果最佳。

2.2 液相色谱条件优化

本文主要考察了3 种色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Waters ACQUITY UPLC HSS T3和Waters ACQUITY BEH C18，结果如图1 所示。其中，沙罗拉纳采集的两对特征离子对（m/z）为581/416、581/444。流动相体系主要考察了液相色谱-质谱分析中的常见流动相体系，即甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵、甲醇-5 mmol·L-1甲酸铵、甲醇-0.1%甲酸水，结果见图2。考察结果表明，3 种色谱柱目标物均能实现较好的分离，且峰形较好；3 种流动相体系中甲醇-5 mmol·L-1甲酸铵流动相梯度洗脱峰形最佳，分离效果最好。考虑到Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱在实验室中较为常备，液相色谱条件最终选取Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱、甲醇-5 mmol·L-1甲酸铵流动相梯度洗脱。

图1 不同色谱柱条件下的MRM 质谱图

图2 不同流动相体系的MRM 质谱图

2.3 检出限和定量限

标准曲线采用空白基质溶液配制，在0 ～200 ng·mL-1线性关系良好，y=22.09x+28.32，r2=0.999。检出限是通过在空白样品中添加低浓度水平目标组分的方法确定，依据其定性离子色谱峰的信噪比（S/N）＞3 而测定的，为2.0 μg·kg-1；定量限是其定性离子色谱峰的信噪比（S/N）＞10 而测定的，为5.0 μg·kg-1。

2.4 耐用性试验

2.4.1 耐用性试验的因素选择

实验室在检测中，不能刻意控制的或不能保持完全一致的微小条件很多，包括前处理各环节温度控制、人员、存放时间、试剂耗材等。在进行耐用性试验时，应根据方法的特点，结合使用的具体情况，合理安排需要考察的微小因素。超声温度因素分别为从室温开始（水温约15 ℃），超声15 min 后水温升高至约30 ℃；将超声仪水温设为30 ℃，待温度平衡后开始超声。滤膜因素：主要考察不同的滤膜是否对目标分析物有吸附，选择的因素分别为两个来源的滤膜。时间因素：主要考察批量处理了样品后，放在进样盘上待进样时是否会影响定量分析的准确性，分别及时检测和间隔3 d 检测（安捷伦液质联用仪最多容许432 个样品，每针进样10 min，第一个样品与最后一个样品间隔72 h，因此定为3 d）。净化柱批次：批次1 为012839092A，批次2 为013239242B。

2.4.2 耐用性试验结果

W.J.尤登教授采用差值排序的方法来判别试验中需要严格控制的因素，并规定差值排在前面一位或两位的因素要引起重视，梳理沙罗拉纳中排名前4的因素差值为检测时间（15.6）、人员（-3.2）、乙腈开瓶时间（-2.69）、进样瓶颜色（2.63），检测时间的差值最大，其余差值相差均不大。沙罗拉纳各个因素的平均结果及其差值，结果见表7 ～表9。

表7 沙罗拉纳耐用性试验结果统计（水平1） 单位：ng·mL-1

表8 沙罗拉纳耐用性试验结果统计（水平2） 单位：ng·mL-1

表9 沙罗拉纳耐用性试验不同水平结果统计分析

2.4.3 耐用性试验结果的统计分析

（1）t检验。分别对排名前4 的因素差值进行t检验[9]。结果表明，检测时间P＜0.05 差异有统计学意义，其余均无统计学意义。结果显示，检测时间对结果的影响较大，检测时应当及时检测，其他因素对检测结果的影响可以忽略，无需严格控制。

（2）各因素差值与标准差比较。E．H．Steiner 介绍了另外一种评价方法，即计算12 次检测结果的标准差，将各个因素的差值与标准差s进行比较，定量评价各个因素变化对检测结果的影响程度。如果差值的绝对值大于（置信概率P=95%），则可认为存在实际的影响，检测中应有控制措施。反之则认为该因素对检测结果无影响。计算出12 次检测结果的平均数和标准差，平均数=83.56，s=10.47，=14.80。结果显示，检测时间（差值=15.60）大于其，即对检测结果影响较大，需要严格控制检测时间这一影响因素。

运用上述两种统计学方法对耐用性结果进行定量评价是对W.J.尤登教授的差值排序方法的一个有效补充，在实际操作时二者任选其一就能将试验结果准确量化，可以在简单的差值排序后，从众多因素中准确找出需要严格控制的影响因素，为检测方法开展协同试验提供技术支撑。同时，也为液相色谱领域开展耐用性试验在因素选择、方案设计和结果评价等方面提供一些参考。

3 结论

猪肝基质复杂，色谱干扰较大，前处理条件考察了超声提取时间、提取溶剂及固相萃取小柱，最终选择用乙腈超声提取15 min，PRiME HLB 固相萃取柱进行净化，净化效果好，色谱干扰较小；液相色谱条件优化主要考察了色谱柱、流动相体系，最终选择Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱、甲醇-5 mmol·L-1甲酸铵流动相梯度洗脱，实现色谱分离完全。该方法操作过程简单，检测速度快，选择性强，灵敏度高，可作为猪肝中沙罗拉纳残留量的检测方法。