大米中内源性香兰素的研究

陈仁熙，孙莹莹，王玉晶，张秀芹

（华测检测认证集团股份有限公司，广东深圳 518101）

香兰素（Vanillin），又名香草醛、3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，是一种应用广泛的食品添加剂和饲料添加剂，在医药、化妆品等行业也有广泛应用[1-3]。天然香兰素是从香荚兰豆中提取，其安全性得到原国家食品药品监督管理总局、美国食品药品监督管理局、欧洲食品安全局和联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会等多个国内外机构的认可，但由于天然产品价格昂贵，目前使用的多为合成产品。目前全球对香兰素的年需求量约为20 000 t，我国2010 年消耗2 000 多吨，约80%用于食品，10%左右用于饲料[4-5]。过多摄入香兰素会导致头晕、恶心、呼吸困难甚至肝肾损伤，对人体存在一定的危害[6]。粮食及农业组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会限制香兰素的每日摄入量应低于10 mg·kg-1。在食品工业领域，我国规定香兰素、香荚兰豆浸膏（提取物）等作为食品用香料使用，但对于某些特殊食品，如大米、巴氏杀菌乳、奶油、新鲜水果、鲜肉、鲜蛋、蜂蜜和饮用纯净水等，不得使用食品类香料、香精。近年来，我国食品风险监测管理中，一旦发现上述食品检出香兰素，即判为高风险产品。

但随着国内外研究的深入，多项研究表明除了香荚兰豆中含有天然香兰素，其他如水稻秸秆、米糠及一些果壳中也存在香兰素，可见，大米中可能存在内源性香兰素。因此，明确大米中是否含有内源性香兰素，对于监管部门和大米的生产经营者十分必要。

本研究利用国家现有的检测方法，《食品中香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素的测定》（BJS 201705）中的高效液相色谱-串联质谱法，对从市场随机购买的来自不同产区的203 份大米进行摸底检测，并对产自国内的10 份水稻样品进行了检测，对香兰素的含量及来源进行了简要分析，以期为政府监管政策的调整提供一定的数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

实验检测的大米样品均为随机购买市售产品，合计203 批大米试样（市售，预包装食品）；10 份稻谷来源于东北产区的种植户。

香兰素标准品（Lot：ALT077120；Purity：99.0%；first standard；CAS：121-33-5）； 乙基香兰素标准品（Lot：FS1611737；Purity：99.2%；first standard；CAS：120-14-9）；甲醇、乙腈、正己烷（色谱纯，MERCK）；甲酸（色谱纯，THERMO FISHER）；氯化钠（在550 ℃灼烧4 h 后备用）；水为超纯水（电阻率=18.2 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪（ESI 源，TSQ Endura，Thermo）；涡旋混合器（VORTEX 3，德国艾卡）；超声波清洗仪（KMH1-240W，GT SONIC）；离心机（H1850R，湘仪）；分析天平（感量0.1 mg 和0.01 g，ME204E，METILER TOLEDO）。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

称取香兰素、乙基香兰素标准品各10 mg，精密称定，加甲醇适量使其溶解并定容至10 mL 容量瓶，配制成1 mg·mL-1的标准储备液；分别精密量取香兰素、乙基香兰素标准储备液各1 mL 于100 mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制成10 μg·mL-1混合标准工作液；分别精密量取10 μg·mL-1混合标准工作液1 mL 和100 μL 于10 mL 容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制成1 000 μg·L-1和100 μg·L-1的混合标准工作液；准确移取100 μg·L-1混合标准工作液50 μL、100 μL，以及1 000 μg·L-1混合标准工作液20 μL、40 μL、80 μL、100 μL，加入适量甲醇将其稀释为5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1和100 μg·L-1系列标准溶液，以绘制标准曲线。

1.3.2 前处理方法

称取（1±0.01）g 样品（大米和米糠），置于50 mL 聚丙烯离心管中，加入3 mL 水，涡旋振荡30 s，加入7 mL 乙腈，涡旋振荡30 s，超声处理25 min，10 000 r·min-1离心5 min 后，取上层清液过0.22 μm滤膜，待分析。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters Xbridge C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相：A 相为0.1%甲酸水溶液，B 相为甲醇，梯度洗脱条件见表1；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：5 µL。

表1 梯度洗脱条件

（2）质谱条件。电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI），正离子扫描，多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式； 干燥气为氮气，温度为350 ℃；雾化气为氮气，雾化器压力为10 psi；毛细管电压：5 500 V；待测化合物定性、定量离子对及碰撞能量、去簇电压等参数见表2。

表2 香兰素的定性、定量离子对及碰撞能量、去簇电压参数

2 结果与分析

2.1 标准曲线线性、检出限及回收率

根据《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的要求，线性相关系数r应＞0.99、回收率应在60%～120%、精密度方面相对标准偏差RSD 应＜21%。由表3 可知，香兰素和乙基香兰素均在5 ～100 μg·L-1呈良好的线性关系，且相关系数均＞0.99。对同一阴性大米样品进行检出限水平重复加标测定以验证方法回收率和精密度（n=6）。香兰素回收率为95.15%，相对标准偏差为2.5%；乙基香兰素回收率为82.98%，相对标准偏差为1.5%。回收率和精密度均满足GB/T 27404—2008 的要求。

表3 大米中香兰素检测方法的回收率、曲线及检出限

2.2 大米及稻谷样品测定结果

随机购买的203 份大米中198 份检出香兰素，含量多在100 ～250 μg·kg-1，详见表4。10 批稻谷脱壳后，分别对米糠及米进行检测，结果全部检出香兰素，米中香兰素含量在217.04 ～456.23 μg·kg-1，米糠中香兰素含量在5 710.91 ～18 470.62 μg·kg-1，详见表5。

表4 203 批大米样品的香兰素检出量

表5 稻谷样品不同部位的香兰素检出量对比

2.3 内源性分析

《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定大米中不得添加香兰素，即检出值达到方法定量意味着该产品不符合要求。本研究中检测的203 批大米中有158 批检测值超100 μg·kg-1，不符合率为76.9%。由于样品是随机购入并分别来源于广东、安徽、江苏、广西、越南、巴基斯坦及柬埔寨等多个产地，同时非法添加的可能性不大，内源性可能性更大。

从表4、表5 可以看出，市场随机购入的预包装大米香兰素含量差异较大；米糠中香兰素含量远远高于米内含量；新脱壳的米中香兰素含量均高于200 μg·kg-1。可能原因为香兰素具有挥发性，其挥发量受保存时间和保存环境的影响，导致其香兰素检出量存在差异；香兰素含量和大米品种密切相关，有研究表明，不同品种的大米香兰素含量存在差异。

有研究表明，米糠中含有大量的香兰素前体物质阿魏酸，阿魏酸的C-C 双键结构在氧化后即可成为香兰素或通过生物转化形成香兰素。香兰素的醛基氧化后即可成为香草酸，阿魏酸、香兰素和香草酸之间具有依次转化关系。严娜等[7]研究表明有色米中含有香草酸（香兰素氧化产物）、阿魏酸及没食子酸等，香草酸含量在9.5 ～110.3 mg·kg-1，阿魏酸含量在27.3 ～84.6 mg·kg-1。

3 结论

根据研究结果，初步判断大米含内源性香兰素的可能性较大。但目前我国规定的检测方法BJS 201705为高效液相色谱串联质谱法，无法分辩内源和外源。建议相关人员加大研究力度，充分论证大米中是否含内源性香兰素，如果存在内源性问题，应及早调整相应的国家标准及监管措施。