金耳总黄酮微波萃取工艺优化研究

殷金玲，马 亮

（1.吉林磐石经济开发区投资促进局，吉林磐石 132300；2.吉林省维伊康生物科技有限公司，吉林磐石 132300）

金耳为担子菌门、银耳科、银耳属的一种金黄色可食用真菌，别称黄木耳、金黄耳、脑耳等[1]。金耳主要分布于我国云贵高原、四川、西藏等地，含有蛋白质、多糖、多酚、黄酮类和胶质等多种营养成分，具有抗氧化、抗血栓、降血糖、降血脂以及提高身体免疫力等功效[2]。

近年来，微波萃取技术在食品加工领域中得到了广泛应用[3]。与其他新型萃取方式如超声波萃取、超高压萃取、超临界萃取和电磁裂解萃取等相比，微波萃取技术在物料控制、溶剂选择、时间效率和生产操作上具有低成本优势。响应面分析法是目前使用广泛的实验分析方法，通过将各种实验影响因素和响应值整合成二次回归方程，确定各因素影响程度大小，进而为实际工业生产提供理论指导依据[4]。

目前，关于金耳的主要研究方向多为药理活性、多糖结构等。例如，刘光珍等[5]研究了金耳糖肽胶囊的技术药理学，张雯等[6]分析了金耳菌丝体多糖的降血糖功效，汪虹[7]概述了金耳药理活性研究及其多糖结构进展研究。黄酮类化合物具有延缓衰老、防癌抗癌、提高心血管功能的作用，但其无法在人体内直接合成，需要从植物中萃取[8]。本实验采用微波萃取技术对金耳中总黄酮类物质进行萃取，以单因素实验为基础，结合响应面实验探究金耳中总黄酮类物质的最佳提取工艺，深度挖掘金耳潜在营养价值，为金耳作为功能性食品原料的整体开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

金耳鲜品采购于四川广元；芦丁对照品，江西佰草源生物科技有限公司；硝酸铝、氢氧化钠、乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；微波炉；粉碎机；电子分析天平；烘箱；UV-9600 型紫外/可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 金耳预处理

将金耳鲜品清洗干净，除去表面泥沙杂质后，切成1 ～2 cm 均匀的块状，放入65 ℃的烘箱内烘干，干燥至恒重，然后用粉碎机粉碎处理，过100 目筛，备用。

1.2.2 芦丁标准曲线绘制

精密称取4.0 mg 芦丁标准品，置于10 mL 容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度线，配制成浓度为0.4 mg·mL-1的标准品溶液，摇匀备用。用移液枪分别吸取芦丁标准品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL 和0.7 mL，然后补加70%乙醇，使溶液总体积为1.2 mL，摇匀。然后加入5.0%亚硝酸钠溶液0.2 mL，再加入10.0%硝酸铝溶液0.2 mL，两次混合均需静置6 min。最后再加入4%氢氧化钠溶液2 mL，充分混合后静置15 min，于510 nm 处测定吸光值。芦丁标准系列溶液浓度分别为0 mg·mL-1、0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.07 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1。以芦丁浓度为横坐标（x），以吸光值为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到的标准曲线线性回归方程为y=0.518x-0.005 4（R2=0.999 5）。

1.2.3 金耳总黄酮的萃取

称取金耳细粉1.0 g，置于250 mL 烧瓶中，加乙醇溶液定容至指定刻度，在适宜的微波功率下加热一段时间，过滤，即可得到金耳萃取液[9]。准确称取5.00 mL 萃取液于50 mL 容量瓶中，稀释10 倍，作为待测样品，备用。

1.2.4 单因素实验

（1）料液比（金耳细粉质量与乙醇溶液体积的比例）的确定。固定微波时间为4 min、微波功率为300 W、乙醇浓度为50%，研究料液比（1∶10、1∶20、1 ∶30、1 ∶40 和1 ∶50，mg ∶mL）对金耳总黄酮萃取率的影响。

（2）微波时间的确定。固定料液比为1 ∶20、微波功率为300 W、乙醇浓度为50%，考察微波时间（1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min）对金耳总黄酮萃取率的影响。

（3）微波功率的确定。固定料液比为1 ∶20、微波时间为4 min、乙醇浓度为50%，考察微波功率（100 W、200 W、300 W、400 W 和500 W）对金耳总黄酮萃取率的影响。

（4）乙醇浓度的确定。固定料液比为1 ∶20、微波时间为4 min、微波功率为300 W，考察乙醇浓度（50%、60%、70%、80%和90%）对金耳总黄酮萃取率的影响。

1.2.5 响应面实验

根据单因素实验结果，以料液比、微波时间、微波功率和乙醇浓度为因素，以金耳总黄酮萃取率为考察指标，采用Design-Expert 13.1.0 软件对金耳总黄酮的萃取工艺进行CCD 响应面设计[10-11]。实验方案见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.2.6 金耳总黄酮含量测定

将测得的吸光值代入芦丁回归方程中，测得萃取液中总黄酮浓度（C），按公式（1）计算样品中金耳总黄酮萃取率[12]。

式中：c为萃取液中金耳总黄酮的浓度，mg·mL-1；v为萃取液体积，mL；n为稀释倍数；m为金耳细粉样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对金耳总黄酮萃取率的影响

由图1 可知，随着提取液体积的增加，金耳总黄酮的萃取率呈先增大后降低的趋势。当料液比为1 ∶20 时，金耳总黄酮萃取率达到最大值，进一步增加提取液体积，金耳总黄酮萃取率呈现下降趋势。因此，最佳料液比为1 ∶20。

图1 料液比对金耳总黄酮萃取率的影响

2.1.2 微波时间对金耳总黄酮萃取率的影响

由图2 可知，当微波时间为4 min 时，金耳总黄酮萃取率最高，超过4 min 总黄酮萃取率开始下降。初步分析，微波通过高频振动，从内向外发散高能热量，升温速度极快。增加微波时间，溶液温度迅速升高，细胞内分子运动频率加快，细胞壁结构被延展、撕裂，加速了黄酮的释放。但黄酮在微波时间过长、温度过高的条件下，其组织结构会遭到破坏，导致萃取率降低。所以确定最佳微波时间为4 min。

图2 微波时间对金耳总黄酮萃取率的影响

2.1.3 微波功率对金耳总黄酮萃取率的影响

由图3 可知，随着微波功率的增大，金耳总黄酮萃取率呈先增大后减小的趋势。当微波功率为400 W 时总黄酮萃取率达到最大值，继续增大微波功率，总黄酮萃取率开始下降，可能是因为微波功率过高时会快速裂解黄酮分子结构，造成含量下降。故确定最适宜的微波功率为400 W。

图3 微波功率对金耳总黄酮萃取率的影响

2.1.4 乙醇浓度对金耳总黄酮萃取率的影响

由图4 可知，金耳总黄酮萃取率在乙醇浓度为60%时达到最大值，进一步增加乙醇浓度，总黄酮提取率呈下降趋势。黄酮易溶于乙醇，乙醇浓度过高会加速金耳中其他极性物质的分解，进而影响金耳总黄酮的释放。故确定最佳乙醇浓度为60%。

图4 乙醇浓度对金耳总黄酮萃取率的影响

2.2 响应面优化实验结果

2.2.1 回归方程的建立与分析

响应面实验结果及方差分析结果见表2、表3。利用Design-Expert 13.1.0 对实验结果进行拟合，得到的回归方程为Y=0.672 2+0.004 6A-0.013 6B-0.016 2C+0.016 3D-0.008 5AB+0.014AC-0.018 7AD-0.01BC+0.004 3BD+0.014 5CD-0.034 5A2-0.041 2B2-0.026 6C2-0.032 1D2。

表2 响应面实验条件与结果

表3 方差分析结果表

由表3 可知，模型中F=16.14，P＜0.000 1，表明确立的回归模型有统计学意义；R2=0.941 6，表明该模型的拟合度较好，实验误差较小。一次项B、C、D、交互项AD以及二次项A2、B2、C2、D2对金耳总黄酮萃取率的影响极显著（P＜0.01）；二次项AC、CD对金耳总黄酮萃取率有显著影响（P＜0.05）；一次项A与交互项AB、BC、BD对金耳总黄酮萃取率的影响不显著（P＞0.05）。金耳总黄酮萃取率受4个单因素的影响程度依次为乙醇浓度＞微波功率＞微波时间＞料液比。

2.2.2 最优工艺参数的确定和验证

经过Design-Expert 13.1.0 软件对实验结果进行拟合，得到金耳总黄酮微波萃取的最佳工艺参数为料液比1 ∶19.8、微波时间3.75 min、微波功率376 W，乙醇浓度62%。在此条件下得到的金耳总黄酮萃取率为0.676 5%。

考虑到实际工业化生产条件及成本，确定最佳工艺参数为料液比1 ∶20、微波时间4 min、微波功率400 W、乙醇浓度60%，该条件下金耳总黄酮萃取率为0.671 2%。该数值与模型最佳工艺参数所得结果基本吻合，表明优化后的工艺参数具有较好的指导性和实际操作性。

3 结论

将新鲜金耳干燥粉碎处理后，采用微波辅助方法萃取金耳总黄酮，并结合单因素实验和响应面实验优化提取工艺，最终得到金耳总黄酮微波萃取的最佳工艺参数为料液比1 ∶20（mg ∶mL）、微波时间4 min、微波功率400 W、乙醇浓度60%，该条件下金耳总黄酮萃取率为0.671 2%。该实验能为萃取金耳总黄酮的后续研究及生产操作提供参考。