香蕉枯萎病拮抗菌的筛选鉴定及其防病效果测定

杨迪 杜婵娟 张晋 潘连富 叶云峰 付岗

摘要：【目的】從不同作物的根围土壤中分离筛选香蕉枯萎病菌拮抗菌，对拮抗菌进行鉴定并测定其防病效果，以期为香蕉枯萎病的生物防治提供新的菌种资源。【方法】以尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense 4，Foc4）Foc 1402菌株为对象，采用稀释涂布法对不同作物根围土壤中的细菌进行分离，并使用平板对峙法和牛津杯法筛选其中的香蕉枯萎病拮抗菌。根据细菌菌落形态、生理生化特征结合16S rDNA序列分析对拮抗菌进行分类鉴定。使用威廉斯B6香蕉杯苗测定拮抗菌对香蕉枯萎病的盆栽防治效果。【结果】从不同作物根围分离获得345株细菌，从中筛选获得7株对香蕉枯萎病菌具有较强拮抗活性的菌株，抑菌率最高可达72.65%。依据形态学观察、生理生化反应和16S rDNA序列分析结果，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株Bc11被鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia），菌株Pt05被鉴定为土地类芽孢杆菌（Paenibacillus terrae）。盆栽试验结果显示，7株拮抗细菌对香蕉枯萎病的防治效果在20.00%～68.89%，其中以菌株Bc11的防治效果最好，为68.89%。【结论】从不同作物的根围土壤中筛选获得7株对Foc具有较强拮抗活性的细菌，其中，土地类芽孢杆菌为香蕉枯萎病生防菌家族的新成员。筛选获得的不同种类拮抗菌可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源，在后续开发抗病复合菌剂方面具有良好的应用前景。

关键词：香蕉枯萎病；生物防治；解淀粉芽孢杆菌；洋葱伯克霍尔德氏菌；土地类芽孢杆菌

中图分类号：S476                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2023）02-0414-10

Abstract：【Objective】This study was conducted to isolate and screen the antagonists against banana fusarium wilt from the rhizosphere soil of different crops， and then identify them and evaluate their control effects，to provide new bacteria resources forthe biological control of banana fusarium wilt. 【Method】Targeting the Foc 1402 strain of Fusarium oxysporum f. sp. cubense 4，Foc 4， the bacteria in rhizosphere soil of different crops were isolated by gradient dilution coating method， and the antagonistic bacteria of banana fusarium wilt were screened by the plate confrontation method and the Oxford cup assay. The isolates were identified by morphological， physiological， biochemical features and the analysis of 16S rDNA sequences. And the control effects of antagonistic bacteria on banana fusarium wilt were evaluated through pot experiments using banana seedlings of Williams B6. 【Result】A total of 345 bacterial strains were isolated from rhizosphere soil of different crops. Of these， 7 strains with strong antagonistic activity against banana fusarium wilt were screened， and the highest inhibition rate was 72.65%. According to the results of morphological， physiological and biochemical characteristics and 16s rDNA sequence analysis， strains Ba02， Ba310， Ba48， Ba62 and Ba63 were identified as Bacillus amyloliquefaciens， the strain Bc11 was identified as Burkholderia cepacia， and the strain Pt05 was identified as Paenibacillus terrae. Pot experiments revealed that the control effects of 7 antagonistic bacteria on banana fusarium wilt were 20.00%-68.89%， and the strain Bc11 was the most effective against banana fusarium wilt （68.89%）. 【Conclusion】In this study， 7 biocontrol bacteria withstrong control effects on banana fusarium wilt were screened from the rhizosphere soil of different crops. Among them， P. terrae is a new member of the biocontrol bacteria family of banana fusarium wilt. At the same time， the different kinds of antagonistic bacteria obtained can serve as candidate strain resources for the development of biocontrol agents against banana fusarium wilt， and have good application prospects in the subsequent development of disease resistant composite bacterial agents.

Key words： banana fusarium wilt； biological control； Bacillus amyloliquefaciens； Burkholderia cepacia； Paenibacillus terrae

Foundation items：National Natural Science Foundation of China （31960520）； Central Government-guided Local Science and Technology Development Fund （Guike ZY21195015）；Guangdong and Guangxi Joint Fund Project （2020B1515420006）； Project of Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests （22-035-31-22ST03）

0 引言

【研究意义】由尖孢镰刀菌古巴专化型［Fusa-rium oxysporum f. sp. cubense （Foc）］侵染引起的香蕉枯萎病是目前世界香蕉产业中发生最严重的毁灭性土传病害（Ghag et al.，2015）。长期以来，多种方法已被尝试用于香蕉枯萎病的防治，如土壤熏蒸、轮作、土壤有机改良等，但该病仍未能得到有效控制（Saravanan et al.，2003；Ploetz，2015a；Dita et al.， 2018；李朝生等，2021；Ismaila et al.，2022）。利用生防微生物防治土传病害可改善土壤微生态环境，丰富土壤微生物区系，避免病菌产生抗性，同时还可促进植物生长，诱导植物的系统防御反应，有助于持续抑制病害（Shen et al.，2015；Wan et al.，2018；常淑娴等，2022；彭雯杰等，2022；Li et al.，2022）。因此，选择拮抗微生物防治香蕉枯萎病是一条值得探究的有效防控途径，而筛选获得具有生防潜能的拮抗微生物是开展生物防治工作的重要基础。【前人研究进展】近年来，多种对香蕉枯萎病具有拮抗作用的生防菌被报道。木霉属（Trichoderma spp.）、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）、芽孢桿菌属（Bacillus spp.）、链霉菌属（Streptomyces spp.）和丛枝菌根真菌是研究较多的香蕉枯萎病生防菌，其中链霉菌属更多仅针对Foc的离体研究，较少进行活体或大田试验（覃柳燕等，2017；Bubici et al.，2019；赖宝春等，2020；李枢妍等，2021；杨迪等，2021）。Napitupulu等（2019）通过对峙培养和挥发性有机物测试，评估了10株哈茨木霉（T. harzianum）对Foc的生防潜力，结果表明所有菌株对Foc均具有拮抗活性，并可产生抑制Foc菌丝生长的挥发性有机物；Lin和Ho（2021）在平板试验中发现蕈状芽孢杆菌（B. mycoides）NP02和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）BaPD1均对Foc TR4具有拮抗作用，将2株菌株用于处理感染枯萎病的香蕉苗，通过比较植株生长状况和叶片养分发现，2株菌株处理均可减轻枯萎病的田间症状，还可增加染病植株叶片中氮含量以及锌、铁、镍等金属离子水平；Raja和Ebenezar（2021）采用平板对峙法测试了分离自14个香蕉种植区的绿色木霉（T. viride）、荧光假单胞菌（P. flourescens）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）对Foc的抑制率，结果显示绿色木霉对Foc的菌丝生长抑制率在57.52%～72.55%；荧光假单胞菌表现出的菌丝生长抑制率为67.17%～82.64%；枯草芽孢杆菌表现出的菌丝生长抑制率为59.69%。Cheng等（2022）以中蕉3号和中蕉4号香蕉苗为材料，研究了丛枝菌根真菌印度梨形孢（Serendipita indica）定殖对香蕉生长和枯萎病抗性的影响，结果表明该菌的定殖显著促进了香蕉苗的生长，还可提高香蕉苗中叶绿素和氮的含量，同时减轻香蕉幼苗上枯萎病症状。Shen等（2022）从香蕉根围土壤中筛选出60株铁载体菌株，以Foc TR4为病原体，筛选出3株拮抗菌，其中菌株Gxun-6的拮抗活性最高，为68.8%，经菌落形态、生理生化分析和16S rRNA进化分析将该菌株鉴定为暹罗芽孢杆菌（B. siamensis）；在盆栽条件下，该菌株对香蕉枯萎病的防治效果可达88.26%，同时可增加香蕉植株的鲜重。然而，由于生防菌本身的特性以及环境条件等因素的影响，能在田间拥有稳定防治效果的生防菌株还较少（Hesran et al.，2019）。【本研究切入点】生物防治是香蕉枯萎病防治的研究热点之一，然而单一的拮抗菌在复杂的田间环境中很难发挥出理想的防治效果。筛选更多种类的生防菌资源，有助于后续抗病复合菌剂的开发，以利于生防菌剂在田间更好地发挥作用。【拟解决的关键问题】采用平板对峙法和牛津杯法从不同作物的根围土壤中分离筛选香蕉枯萎病拮抗菌，通过形态学观察、生理生化测定及16S rDNA序列分析对拮抗菌进行鉴定，并通过盆栽试验测定拮抗菌的防病效果，以期为香蕉枯萎病的生物防治提供新的菌种资源。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试菌株：尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（F. oxysporum f. sp. cubense 4，Foc4）Foc 1402菌株，由广西农业科学院植物保护研究所香蕉病害研究团队分离保存。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1 L、pH自然。NA培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、琼脂15 g、水1 L、pH 7.0；不加琼脂为NA液体培养基（方中达，2001）。

供试香蕉苗：长势一致的5叶龄威廉斯B6健康香蕉杯苗，购自南宁香洁农业科技有限公司。

1. 2 拮抗细菌分离筛选

1. 2. 1 土壤微生物分离 采用五点取样法采集不同作物根围距离地表3～10 cm处土壤，参照付岗等（2007）的方法制备土壤悬浮液，并进行10倍梯度稀释。分别取100 ?L稀释倍数为10-4、10-5和10-6的土壤悬浮液在NA培养基上进行涂布，28 ℃恒温培养，24 h后挑取形态不同的单菌落进行纯化后4 ℃保存备用。

1. 2. 2 Foc拮抗菌初筛 将Foc 1402在PDA培养基上28 ℃培养3 d后，用直径为5 mm的灭菌打孔器沿菌落边缘打取菌饼。将菌饼置于PDA培养基中央，28 ℃下培养24 h后，将待测细菌在距菌饼2 cm处划线，继续置于28 ℃培养，4 d后选取有3 mm以上抑菌带的菌株进行下一步筛选。

1. 2. 3 Foc拮抗菌复筛 参照杨迪等（2021）的方法，制备拮抗菌发酵液和病原菌分生孢子悬浮液，采用牛津杯法测定各拮抗菌株发酵上清液的抑菌圈直径，并计算抑菌率。以无菌水为对照，每处理3次重复。选取抑菌率高的菌株进行后续试验。

抑菌率（%）＝（处理抑菌圈直径－对照抑菌圈直径）/处理抑菌圈直径×100

1. 3 拮抗菌株鉴定

1. 3. 1 形态学观察 将筛选获得的拮抗菌株在NA培养基上28 ℃培养48 h，定期观察记录菌落形状、透明度及菌落颜色等菌落特征，并在光学显微镜下观察细菌形态。

1. 3. 2 生理生化反应测试 参照杭州微生物试剂有限公司葡萄球菌生化鉴定管和肠杆菌科细菌生化鉴定管说明书进行生理生化反应测试。反应结果判定参照《伯杰细菌鉴定手册》（Bergey，2001）。

1. 3. 3 分子鉴定 将拮抗菌株接种于NA液体培养基，28 ℃下120 r/min振荡培养16 h，取1 mL菌液，12000 r/min离心1 min收集菌体。使用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取菌株基因组DNA。使用通用引物27F/1492R（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/5'-GGTTACC TTGTACGACTT-3'）扩增拮抗菌株的16S rDNA序列。PCR扩增产物测序结果在NCBI网站进行BLAST比对，使用MEGA X采用邻接法构建系统发育进化树。

1. 4 拮抗菌盆栽防治效果测定

参照1.2.3方法制备拮抗菌发酵液和病原菌分生孢子悬浮液。将长势一致的5叶龄香蕉苗移栽至以蛭石为基质的塑料盆内，室温定植10 d后，用小刀沿香蕉根围进行伤根处理。每株蕉苗接种孢子浓度为1×106个/mL的病原菌分生孢子悬浮液40 mL，同时淋入100 mL浓度为1×108 CFU/mL的拮抗菌发酵悬浮液，7 d后再次淋入等量相同浓度的拮抗菌发酵悬浮液，以无菌水为对照。每处理3次重复，每重复6株蕉苗。接种21 d后，参照杜婵娟等（2020）的分级标准，依据蕉苗球茎纵剖面褐变面积占比确定病级，调查发病情况，并计算各处理病情指数和防治效果。

病情指数=∑（各级发病株数×该级代表值）/（总株数×最高级代表值）×100

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100

1. 5 统计分析

利用Excel 2016對试验数据进行计算处理，并使用SPSS 18.0的Duncans新复极差法分析各处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2. 1 微生物分离与拮抗菌筛选结果

采用梯度稀释涂布法从采自不同作物的根围土壤样品中分离得到345株细菌，经平板对峙法初筛，从中筛选得到48株对香蕉枯萎病菌具有拮抗活性的细菌，其中以香蕉根围土壤的拮抗菌分离率最高，为27.3%（表1）。

采用牛津杯法复筛后，得到7株抑菌率较高的拮抗菌（图1），其中抑菌率最高的为菌株Ba63，抑菌圈直径为33.35 mm，抑菌率高达72.65%；抑菌能力较弱的是Pt05，抑菌率为37.27%（表2）。

2. 2 拮抗菌鉴定结果

2. 2. 1 拮抗菌形态学鉴定 28 ℃条件下，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63在NA培养基上培养24 h后形成稍透明的乳白色圆形菌落，表面光滑湿润，边缘整齐，易挑起，在显微镜下可观察到菌体呈杆状（图2-A～图2-J）；在NA培养基上培养48 h后，菌株Bc11形成白色圆形单菌落，中间隆起，边缘光滑，易挑起，显微镜下菌体呈杆状（图2-K和图2-L）；菌株Pt05形成圆形米白色单菌落，中部低凸，表面粗糙不透明、难挑起，显微镜下菌体呈杆状（图2-M和图2-N）。

2. 2. 2 拮抗菌生理生化测定 对拮抗菌株的生理生化测定结果（表3）显示，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63可水解淀粉，能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘露糖，不能分解麦芽糖、乳糖和甘露醇；革兰氏染色、鸟氨酸、尿素、V-P试验和硝酸盐还原反应为阳性；硫化氢和甲基红反应呈阴性。该5株菌株的生理生化特征与解淀粉芽孢杆菌（Wang et al.， 2012）基本一致。

菌株Bc11能利用葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖，不能利用麦芽糖、乳糖、甘露糖和甘露醇，不能水解淀粉；鸟氨酸、尿素试验和硝酸盐还原反应为阳性；革兰氏染色、硫化氢、甲基红和V-P试验呈阴性。该菌株的主要生理生化特征与洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacian）（Zhao et al.，2014）基本一致。

菌株Pt05可分解葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和甘露糖，能水解淀粉，不能分解木糖和甘露醇；革兰氏染色、硫化氢、硝酸盐还原反应、鸟氨酸、尿素和V-P试验为阴性；甲基红反应呈阳性。该菌株的主要生理生化特征与土地类芽孢杆菌（Paenibacillus terrae）（Yoon et al.，2003）基本一致。

2. 2. 3 拮抗菌株分子鉴定 分别将7株拮抗菌株的16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST对比，结果显示，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63与解淀粉芽孢杆菌的同源性最高，最高均达100%；菌株Bc11与洋葱伯克霍尔德氏菌的同源性最高，最高达99.85%。菌株Pt05与土地类芽孢杆菌的同源性最高，最高达99.61%。

基于菌株的16S rDNA，采用邻接法分别构建系统发育进化树。结果显示，菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63与3株解淀粉芽孢杆菌（MK182997、MG264882和KU363819）以95%的自展支持率聚于同一分支，与芽孢杆菌属（Bacillus spp.）其他种可明显区分（图3-A）；菌株Bc11以90%的自展支持率与2株洋葱伯克霍尔德氏菌（AB051408和JX081590）聚于同一分支，与其他15株伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia spp.）参比种可明显区分（图3-B）；拮抗菌Pt05与2株土地类芽孢杆菌（MT634584和LC127093）聚于同一分支，自展支持率为100%，与其他类芽孢杆菌属（Paenibacillus spp.）可明显区分（图3-C）。结合菌株形态特征及生理生化特征，将拮抗菌Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63鉴定为解淀粉芽孢杆菌；菌株Bc11鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌；菌株Pt05鉴定为土地类芽孢杆菌。

2. 3 拮抗菌的盆栽防治效果

蕉苗处理21 d后，接种病原菌的对照组叶片变黄，而拮抗菌发酵悬浮液处理的蕉苗大多仍保持绿色（图4-B）。对照组病情指数为71.43，各拮抗菌发酵悬浮液处理的病情指数在22.22～57.14，显著低于对照组（P<0.05），表明7株拮抗菌对香蕉枯萎病均有显著的抑制作用。从防治效果看，各菌株的防效在20.00%～68.89%，其中，菌株Bc11、Ba62和Ba02对香蕉枯萎病的防治效果较好，防效均在60.00%以上（图4-A）。

3 讨论

香蕉枯萎病是一种典型的土传病害，在世界多数香蕉主产国均有发生，目前尚无有效的单一防治方法（Ploetz，2015b）。近年来，以生物防治为主的综合防控措施受到越来越多学者的关注（Thangavelu and Mustaffa，2012）。而筛选出具有良好生防潜能和不同种类的拮抗菌是香蕉枯萎病生物防治成功的前提，对后续田间应用的防治效果具有决定性作用。本研究在筛选香蕉枯萎病生防菌的过程中发现，尽管在不同作物的根围土壤中均能分离出Foc拮抗菌，但拮抗菌分离率存在差异，其中以香蕉园土壤的Foc拮抗菌分离率最高。其原因可能是在发生枯萎病的香蕉园内，在病原菌的选择压力下，健康植株的根围由于募集有更多的Foc生防菌从而表现相对抗病（Haas and Defago， 2005）。因此，在香蕉根围更容易分离到Foc的拮抗菌。另外，在香蕉根围分离出的拮抗菌也势必更适应香蕉根围环境，将更容易在蕉园生态系统定殖和发挥作用（Pliego et al.， 2011）。这意味着在生防菌的筛选策略上，用于分离生防菌的样品最好来源于发生目标病害种植园中的健康植株周围。

本研究从不同作物的根围土壤中分离出7株对Foc具有较强拮抗活性的细菌，通过形态学鉴定、生理生化测定及16S rDNA序列分析，将分离得到的7株拮抗菌鉴定为3个种，其中菌株Ba02、Ba310、Ba48、Ba62和Ba63被鑒定为解淀粉芽孢杆菌，菌株Bc11被鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌，菌株Pt05被鉴定为土地类芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌具有产生抗真菌脂肽、诱导植物抗性、促进作物生长等功能，已有较多用于防治香蕉枯萎病的报道（Xue et al.，2015； Wang et al.，2016）。洋葱伯克霍尔德氏菌用于防治香蕉枯萎病的报道较少见。Pan等（1997）曾探讨过洋葱伯克霍尔德氏菌在香蕉根围的定殖情况，认为该菌具有防治香蕉枯萎病的潜力，但并未明确其防病效果。漆艳香等（2017）在温室条件下测试了洋葱伯克霍尔德氏菌菌株TY对香蕉枯萎病的防治效果，结果表明该菌株的防治效果低于20%。而本研究筛选出的洋葱伯克霍尔德氏菌菌株Bc11对Foc 1402具有明显的拮抗作用，盆栽防治效果达68.89%。有研究表明，土地类芽孢杆菌作为生防菌，在盆栽条件下可降低番茄灰霉病的发生率，并有促生作用（Kim et al.，2017），对稻瘟病也有良好的防治效果（Yu et al.，2019），但尚未见用于防治香蕉枯萎病的报道。本研究首次发现土地类芽孢杆菌也可用于香蕉枯萎病的防治。本研究获得的这些生防菌，为香蕉枯萎病的生物防治提供了新的菌种资源。

本研究还发现，拮抗菌在平皿中对Foc的拮抗活性强弱与其在盆栽试验中的防病效果高低并不完全一致。如，在平皿中抑菌率较高的菌株Ba63（抑菌率72.65%）在盆栽试验中的防治效果仅为43.33%，远低于菌株Bc11的防治效果（68.89%）；同为解淀粉芽孢杆菌，菌株Ba63在平皿中抑菌率显著高于菌株Ba02（51.32%），而在盆栽试验中则表现为菌株Ba02的防治效果（60.00%）高于Ba63（43.33%）。这一结果表明仅依靠平板对峙筛选拮抗菌存在一定的缺陷，可能无法筛选到通过诱导寄主抗性等机制发挥作用的微生物，而错失一些具有生防潜能的优良菌株（Knudsen et al.， 1997；Daayf et al.， 2003）。因此，采取多种筛选方法相结合的手段将是获得不同生防机制抗病微生物的有效策略。此外，这一结果也暗示了本研究筛选出的7株生防菌除产生抑菌物质外可能存在其他的防病机制。有研究表明，不同种类生防菌的防病机制不同，拮抗菌在平皿上表现出的拮抗活性主要体现了菌株分泌抑菌物质的活性与能力，然而在盆栽防治试验中，防病效果不仅与抑菌物质相关，还与菌株的定殖能力、生态竞争力及诱导宿主抗病性等能力相关（Singh， 2014）。而多种防病机制不同的生防菌联合应用可能具有更好的防病效果（Parnell et al.， 2016）。本研究筛选出的7株生防菌的防病机制可能存在差异，具有复配增效和增加菌剂防效稳定性的应用潜力。

4 结论

本研究从不同作物的根围土壤中分离筛选出7株对Foc具有较强拮抗活性的细菌，通过形态学鉴定、生理生化测定及16S rDNA序列分析，7株拮抗Foc细菌分别鉴定为解淀粉芽孢杆菌、洋葱伯克霍尔德氏菌和土地类芽孢杆菌。其中，土地类芽孢杆菌为香蕉枯萎病生防菌家族的新成员，为香蕉枯萎病的防治提供了新的生防菌资源。同时，分属于3个种属的拮抗菌株可作为研制香蕉枯萎病生防菌剂的候选菌株资源，在后续开发抗病复合菌剂方面具有良好的应用前景。

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（責任编辑 麻小燕）