常规粳稻浙粳78 优质双抗的分子特征分析

陈佑源 蒋宁飞 尚子帅 巫明明 叶 靖 叶胜海

（1.浙江勿忘农种业股份有限公司 浙江 杭州 311215；2.建德市农业技术推广中心 浙江 建德 311600；3.浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所 浙江 杭州 310021）

21 世纪以来，浙江省水稻播种面积呈下降趋势，2001 年全省稻谷种植面积134 万hm2，2021 年约为63 万hm2，仅为前者的47%。 尽管如此，水稻依旧是浙江省第一大粮食作物，年均产量498.78 万t，占粮食总产的83.13%[1]。然而，浙江地处亚热带中部，属季风性湿润气候， 气温适中， 光照充足， 雨量丰沛，不仅是适宜水稻种植的重要地区， 同时也是水稻病虫害如稻瘟病、 白叶枯病的高发区。 因此， 稻瘟病和白叶枯病已成为该地限制水稻产量和品质的两大重要病害。 其中， 稻瘟病分布遍及世界各稻区， 流行年份稻谷一般减产10%~20%， 严重时减产40%~50%，局部田块甚至颗粒无收， 每年损失的稻谷足以养活6 000 万人口。 目前我国稻瘟病的平均发生强度、 年发生面积及稻谷损失分别为25.21%、380 万~600 万hm2及15 亿~30 亿kg[2-4]。 尽管浙江省稻瘟病平均发生强度全国最低，仅为4.46%，但近年来浙江部分地区存在大范围发生趋势[5-6]。 而白叶枯病则主要流行于我国华东、华南和华中稻区，一般造成稻谷产量损失10%~30%，严重时达50%，甚至绝收。 在20 世纪80～90 年代，该病在浙江省发生较重，而后总体趋势为轻发，但2015 年后又趋于加重，甚至在浙东南部分区域连片暴发， 严重影响粮食生产安全及农药减量增效工作成效[7-9]。 因此，面对“老问题新暴发”的水稻白叶枯病，2021 年浙江省将其列入首批二类农作物病虫害名录，同时自2022 年开始，在水稻区试审定标准中将白叶枯病抗性与稻瘟病抗性列为同等重要位置，同时实施“一票否决”制。

在水稻生产上，为了防治上述病害，一般通过喷施农药或种植抗性水稻品种来控制， 但农药防治既污染环境也危害人类身体健康。 目前农业供给侧结构性改革正推动我国农业向绿色化转型发展[10]。培育并推广应用多抗水稻品种及品种合理布局， 减少农作物化学农药用量，是实现农业绿色生态生产，保障农业生产安全、 农产品质量安全和生态环境安全的科学有效途径。 为了适应新时代的生产要求，浙江省自2022 年开始实行水稻新品种审定标准，如多个优异性状累计标准， 即在优质与抗性等方面优异性状越多，则对产量要求相对放宽。 本研究基于稻米食味关键基因、 稻瘟病和白叶枯病抗性基因功能型或紧密连锁分子标记，对单季常规粳稻浙粳78 的优质双抗基因进行分子分析， 以期为该品种的推广应用及进一步遗传改良奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻品种浙粳78 （浙江勿忘农种业股份有限公司）种子发芽后，用Yoshida 营养液于组织培养室恒温培养至3 叶1 心， 而后剪取完全展开叶用于基因组DNA 提取。

1.2 稻米品质、稻瘟病及白叶枯病抗性评价

评价数据均来源于国家水稻数据中心（http://www. ricedata.cn/variety/index.htm）。 稻瘟病及白叶枯病的相关数据均为2 年平均值。

1.3 基因组DNA 提取与抗性基因分子检测

取0.1 g 水稻叶片， 用水稻基因组DNA 提取试剂盒（易思得生物科技有限公司）提取基因组DNA。

常规PCR 反应总体系20 μL，内含1× BlueStarTMPCR Master Mix（北京擎科生物科技有限公司）、上下游引物各1.5 μmol/L 及基因组DNA 50 ng。 PCR 反应程序： 95℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火时间30 s，72℃延伸30~60 s，共35 个循环；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 产物采用2.5%琼脂糖凝胶进行电泳，用紫外凝胶成像仪拍照。 而需要测序或用CAPS/dCAPS 标记验证的部分基因，PCR 反应总体系50 μL， 内含1× Phanta Max 缓冲液、dNTP 0.2 mmol/L、Phanta Max 高保真DNA 聚合酶 （南京诺唯赞生物科技股份有限公司）、 上下游引物各1.5 μmol/L 及基因组DNA 50 ng。 PCR 反应 程序：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，退火时间15 s，72℃延伸30~60 s，共35 个循环；72℃再次延伸5 min，最后保持在16℃。 PCR 产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化DNA 片段，而后送北京擎科生物科技有限公司测序。 酶切反应体系：总体积30 μL，内含3 μL PCR 产物、1 μL 限制性内切酶及1× 反应缓冲液。 所有基因分析的相关引物序列见表1。

表1 抗病基因的分子标记和基因克隆的引物

2 结果与分析

2.1 稻米食味品质相关基因的分子特征

除Wx 基因外，Tian 等[11]和谢米雪等[12]根据关键核苷酸多态性均将水稻淀粉合成途径中的其他重要基因分成2 种单倍型， 其中SBE3 基因的3’UTR 第63 个碱基的变异将导致SpeI 限制性内切位点的改变，缺失的为Ⅰ型，反之则为Ⅱ型；AGPiso 基因的终止密码子下游第532 个碱基G 的变异导致EcoRI 限制性内切位点的改变，缺失的为Ⅰ型，反之则为Ⅱ型；AGPlar 基因的起始密码子上游第1 633 个碱基存在C/T 的变异，含C 的为Ⅰ型，含T 的为Ⅱ型；ISA 基因的起始密码子上游第1 499 个碱基存在C/G 的变异，含C 的为Ⅰ型，含G 的为Ⅱ型；SSII-3 基因的起始密码子后的第4 329 个及第4 330 个碱基存在GC/TT的变异，含TT 的为Ⅰ型，含GC 的为Ⅱ型；SSI 基因的起始密码子后的第3 216 个碱基存在A/T 的变异，含T 的为Ⅰ型，含A 的为Ⅱ型；SSIV-2 基因的起始密码子后的第437 个碱基存在InDel 差异，扩增片段大小为210 bp 的为Ⅰ型，而片段大小为198 bp 的为Ⅱ型。 同时研究发现， 含有Ⅱ型SSI 和AGPlar 及Ⅰ型SSII-3 的稻米直链淀粉含量相对更低； 含Ⅰ型AGPiso、SBE3 和ISA 基因的稻米糊化温度相对更低；含有Ⅱ型SBE3、ISA 和SSIV-2 及Ⅰ型SSII-3 的稻米碱消值相对更低。分析浙粳78 中的上述基因特性，结果发现SSII-3和SBE3 为I 型， 其他5 个基因为Ⅱ型（图1）。

图1 浙粳78 中与稻米食味及蒸煮品质相关基因的分子分型

2.2 稻瘟病抗性基因的鉴定

浙江省单季粳稻2 年区试结果显示，浙粳78 的苗叶瘟均值及其最高级均值、穗瘟发病率均值及其最高级均值、穗瘟损失率均值及其最高级均值、稻瘟病综合指数均值分别为1.5 级和3.0 级、5.5 级和7.0 级、1.5 级和2.0 级、2.9， 最终该品种的稻瘟病抗性定为中抗。 为了明确该品种中是否携带白叶枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或紧密连锁分子标记进行鉴定， 结果表明， 该品种中含有抗病基因Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita、Pikm2、Pik（图2）。

图2 稻瘟病抗性基因的PCR 鉴定

2.3 白叶枯病抗性基因的鉴定

2018 年和2019 年浙江省单季常规粳稻区试结果显示，浙粳78 的白叶枯病均值及其最高级均值分别为2.0 级和3.0 级，该品种白叶枯病抗性综合评定为中抗。 为了明确该品种中是否携带白叶枯病抗性基因， 利用已克隆抗性基因的功能型或紧密连锁分子标记进行鉴定，结果表明，该品种中含有抗病基因Xa21（图3）。 同时进一步对Xa25/xa25 基因测序并与已知抗性基因序列[13]比对分析，证实浙粳78 中含有抗病基因xa25（图3、图4）。

图3 白叶枯病抗性基因的PCR 鉴定

图4 xa25 基因的测序分析

3 讨论与结论

优质稻米，不仅需要漂亮的外观品质，更在于优异的内在蒸煮食味品质。 而后者是由糊化温度、直链淀粉含量、胶稠度等理化指标间接决定，一般来说，优质稻米具有较低直链淀粉含量、 较高胶稠度和较低糊化温度等优点。 研究显示，含有Ⅰ型SSⅡ-3，Ⅱ型AGPlar 和SSⅠ稻米种质的直链淀粉含量相对更低； 含有Ⅱ型AGPsio、SBE3 和ISA 的胶稠度相对较高；而糊化温度与碱消值反相关，含有Ⅱ型ISA 稻米种质的碱消值相对更低[11,14-15]。本研究结果显示，浙粳78 中含有Ⅰ型SSⅡ-3 和SBE3， Ⅱ型ISA、AGPsio、SSIV-2、AGPlar 和SSⅠ。 因此，从直链淀粉及胶稠度的角度来看，该品种携带的基因均为优良基因，而从碱消值的角度来看，ISA 则不是优良基因。

要实现水稻生产的绿色生态发展， 培育多抗水稻新品种是最重要且经济有效的途径。 根据寄主与病原物互作的性质， 可以把植物抗病性区分为垂直抗病性（vertical resistance）和水平抗病性（horizontal resistance）两类[16-17]。 其中前者是通过植物病害抗性基因识别和它对应的病原物Avr 基因， 并产生高效专化性抗性免疫反应，其抗性程度高、有效性强被广泛用于现代抗病育种和生产上[18]。本研究利用多种病害抗性基因的功能型或紧密连锁分子标记， 并结合部分基因的PCR 克隆及测序分析，结果证实浙粳78携带有Pish、Pib、Pi36、Pi-co39、Pita 和Pikm2 等稻瘟病抗性基因， 以及白叶枯病抗性基因xa25 和Xa21，从而赋予该品种稻瘟病及白叶枯病双中抗抗性。